论文部分内容阅读
目的:本研究拟利用在体注射及电穿孔技术,建立FVB/N小鼠骨骼肌特异性过表达PGC-1α模型。研究方法:1.质粒转染效率鉴定:C2C12成肌细胞进行转染实验,利用Flag-PGC-1α质粒进行转染,转染48小时后,检测PGC-1α蛋白表达,鉴定质粒转染效率。2.骨骼肌质粒注射后时效性观察:雄性6-8月龄FVB/N小鼠,随机分成3组:转染5天组(简称5D),转染10天组(简称10D),转染15天组(简称15D),每组10只,检测PGC-1α蛋白的表达,确定骨骼肌质粒注射后的最佳检测时间。3.骨骼肌特异性PGC-1α过表达模型建立:雄性6-8月龄FVB/N小鼠,随机分成3组:对照组(空载质粒注射,称为Negative Control,简称NC),GFP组和Flag-PGC-1α质粒组,每组10只。Flag-PGC-1α质粒组胫骨前肌注射Flag-PGC-1α质粒(2μg/μl,40μl),并利用电穿孔法促进转染,GFP组胫骨前肌注射GFP质粒(2μg/μl,40μl)+电穿孔法促进转染,NC组胫骨前肌注射pUC DNA 3.1空载质粒(2μg/μl,40μl)+电穿孔法促进转染。注射后10天,将实验动物进行处死取材,提取胫骨前肌、心肌进行相关检测。4.骨骼肌特异性PGC-1α过表达模型鉴定:1)组织学检测(HE染色):分别对正常组(空白组)、NC组、Flag-PGC-1α组小鼠的胫骨前肌,进行HE染色,对其骨骼肌肌纤维进行病理学形态检测及分析。2)Western blot法检测胫骨前肌和心肌相关蛋白表达:PGC-1α、GFP、mtTFA、NF-κB、MnSOD、FNDC5。结果:1.Flag-PGC-1α质粒转染C2C12成肌细胞48h后,western blot结果显示,PGC-1α蛋白整体表达水平显著高于对照组,提示Flag-PGC-1α质粒转染效率较好。2.将5D、10D和15D三组小鼠胫骨前肌中PGC-1α蛋白表达量进行比较,10D组中PGC-1α蛋白表达水平最高,提示骨骼肌进行PGC-1α转染后第10天为最佳检测时间。3.对NC组和GFP组进行GFP蛋白表达分析,显示GFP蛋白在GFP组表达成功,而NC组没有表达。4.HE染色结果显示,Flag-PGC-1α注射组的肌纤维相对于NC组有趋于愈合的趋势。5.对实验小鼠的胫骨前肌进行蛋白水平检测,Flag-PGC-1α组中mtTFA蛋白表达水平相对于NC组有显著性升高;Flag-PGC-1α组与NC组相比,FNDC5蛋白表达水平显著性升高;NF-κB、MnSOD蛋白表达水平在各组之间没有显著性差异。6.对实验小鼠的心肌进行蛋白水平检测,与NC组相比,Flag-PGC-1α组中心肌FNDC5、mtTFA表达量显著性升高。结论:1.成功地建立了小鼠骨骼肌特异性过表达PGC-1α模型,表现为骨骼肌PGC-1α表达升高,其下游线粒体转录相关因子、肌肉因子相关蛋白表达升高。2.骨骼肌特异性过表达PGC-1α引起心肌线粒体生物合成相关蛋白表达升高,提示可能存在骨骼肌-心肌交互作用,具体机制有待进一步研究。