【背景】临床上储存红细胞（RBC）输入常用于治疗贫血或急性失血（如失血性休克），通过增加体内血红蛋白（Hb）含量维持组织和器官氧供。每年全世界收集约8000万单位RBC，在美国每年约有1500万单位RBC用于临床治疗，回输前RBC的平均储存时间约为17天。RBC在体外储存过程中发生一系列生理生化、形态结构和功能变化，称为“储存损伤”。此外，RBC回输是一项经验性的治疗，在用于临床之前没有经过严格的前瞻性随机对照研究。越来越多的证据显示储存RBC输入可能与感染、死亡率增加、多器官功能衰竭、住院时间延长等不良反应相关。储存RBC输入后发生不良反应的确切机制尚不明确。RBC体外储存过程中随着储存时间延长溶血率增加，而且约有25% RBC在回输后24小时内被破坏造成血管内溶血。研究表明游离Hb与一氧化氮（NO）发生加氧反应的速度较RBC内的Hb大大增加，很少量的游离Hb就能极大的降低血管内皮中NO的生物利用率。NO是人体生理功能发挥的重要信号分子。NO具有调节血流、扩张血管、增加血管反应性、抑制平滑肌细胞增殖、抑制血小板活化、调节血管通透性、介导免疫反应、参与神经传递的重要作用。NO生物利用率下降将导致内皮功能障碍、粘附分子表达、血小板和凝血因子活化及氧自由基（ROS）产生等不良反应。RBC能够通过细胞内的NO合酶（NOS）和去氧Hb的亚硝酸还原作用生成NO。RBC体外储存之后，NO的生成减少。因此我们推测储存RBC回输的不良反应可能与NO生成减少、破坏增多导致血管内NO生物利用率降低有关。内皮功能障碍是指由于血管内NO含量降低，给予乙酰胆碱后内皮依赖性血管扩张反应降低。通常内皮功能障碍与糖尿病和高脂血症有关。在db/db小鼠和喂饲高脂饮食的WT小鼠（HFD小鼠）中有明显的内皮功能障碍。本研究通过建立小鼠RBC储存和输入模型，将储存RBC输入健康和内皮功能障碍小鼠中，研究NO生物利用率降低在储存RBC回输不良反应中的影响及其作用机制，同时观察通过补充外源性的NO对储存RBC回输不良反应的预防和治疗作用。实验一小鼠RBC储存损伤研究【目的】研究小鼠RBC体外储存后储存损伤程度，建立合适的小鼠RBC储存系统。【方法】将C57BL/6小鼠麻醉后开胸心脏取血。每次约抽取25只小鼠全血进行混合，加入14% CPDA-1作为抗凝剂和储存液。滤除全血中的白细胞（WBC）后，离心将剩余血液浓缩至血球压积（Hct）为70-75%，分装至无菌的离心管中4°C保存。将RBC分成两组：新鲜RBC组（储存时间<24小时，FRBC）和储存RBC组（储存时间为2周，SRBC）。比较两组RBC的生理生化指标差异，观察储存后RBC形态和功能的变化。【结果】1.生化指标变化：与FRBC相比，SRBC中pH、PO₂、HCO₃-显著下降；PCO₂、SBE、BUN和乳酸水平明显上升，说明RBC经体外储存后发生代谢性酸中毒；细胞外Na^＋显著降低，同时K^＋水平显著上升，提示随着储存时间延长，RBC细胞膜上Na-K-ATP酶活性丧失。SRBC溶血率是FRBC溶血率的8倍。与FRBC相比SRBC上清液中游离Hb和metHb的含量明显升高。2.形态学改变：将FRBC和SRBC涂片后染色发现FRBC中大多数RBC为正常双凹圆盘状结构。RBC储存两周后细胞形态发生改变，大多数为形态异常的棘红细胞、棘球状红细胞、裂口红细胞和球形红细胞，细胞形态的改变提示有细胞膜丧失，细胞变形能力降低。3.功能变化：与FRBC相比，SRBC细胞内ATP和2,3-DPG含量明显降低，Hb氧离曲线（ODC）左移，P50显著降低，提示RBC对氧的的亲和力增加，不利于外周器官氧的释放。分别将FRBC和SRBC回输检测RBC回输后的恢复率，结果表明部分SRBC在回输后24小时内被迅速清除，RBC生存曲线斜率与FRBC相比有显著差异（P<0.0001）。从24小时至第8天，FRBC与SRBC的下降的速率没有显著差异。回输24小时后，FRBC的恢复率为99%；SRBC的恢复率为68%，与FRBC相比31％的SRBC输入后24小时被破坏清除，将增加血管内溶血和游离Hb含量。与FRBC相比，SRBC上清液中的TXB2含量显著增加，表明SRBC上清液具有促凝作用。【结论】小鼠SRBC体外储存2周后发生显著的生理生化、形态结构和功能改变。表现为pH下降发生代谢性酸中毒、细胞内外的离子分布失衡、ATP含量下降，伴随RBC细胞膜丧失，细胞形态结构改变，RBC变形能力降低。2,3-DPG降低，RBC与氧亲和力增加，RBC回输后生存率降低，SRBC上清液中存在大量游离Hb。将各项指标与人储存RBC比较，储存2周小鼠RBC与储存6周人RBC储存损伤程度相似。实验二NO生物利用率对储存RBC回输的影响及机制研究【目的】研究储存RBC回输对健康和内皮功能障碍HFD和db/db小鼠的影响，探讨NO生物利用率在其中的作用和机制。【方法】将36只野生型C57BL/6 （WT）小鼠平均分成3组（n=12）：对照组（control）不接受任何输血或输液；新鲜RBC输入组（FRBC）经尾静脉注射占全身血容量10% （相当于临床一个单位RBC输入），储存时间小于24小时的新鲜RBC；储存RBC输入组（SRBC）经尾静脉输入占全身血容量10%，储存时间为2周的储存RBC。将24只喂饲4-6周高脂饮食的（HFD）小鼠（n=12）平均分为3组，其分组方式与WT小鼠相同。将90只遗传背景为C57BL/6的自发糖尿病（db/db）小鼠随机分成9组：对照组、FRBC组、SRBC组处理方式与WT以及HFD小鼠相同；SRBC＋iNO组在输入SRBC之前10分钟开始吸入80百万分率（parts per million, ppm）NO，并维持2小时；FRBC和SRBC上清液输入组经尾静脉分别输入FRBC或SRBC离心后的上清液；洗涤FRBC和洗涤SRBC组经尾静脉分别输入洗涤FRBC或SRBC；SRBC上清液氧化组经尾静脉输入氧化的SRBC上清液。一部分WT和db/db小鼠在经过尾静脉注射后10分钟处死，取血测量各种生化指标。其余动物注射后无创监测血压2小时后处死，取血液测量各项生化指标后离心，将获得的血浆储存。同时储存动物的器官留作分析。【结果】由于直接输入了Hct为70-75%的浓缩RBC，因此将FRBC和SRBC输入WT、HFD和db/db小鼠均导致Hct和总Hb含量较对照组增加。与对照组相比血浆游离Hb含量FRBC和SRBC输入组均显著增加。各SRBC输入组血浆游离Hb与FRBC组相比显著增加。将SRBC输入WT小鼠10分钟后后血乳酸水平显著增加，说明存在代谢性酸中毒。除此之外，其它生化和血液指标在各组间无显著差异，说明小鼠能耐受小剂量SRBC直接输入而不发生明显的生化改变。输入FRBC或SRBC对WT和HFD小鼠收缩压（SBP）没有明显影响。与输入FRBC相比，将SRBC输入db/db小鼠后SBP显著升高。吸入80 ppm NO将SRBC输入引起的高血压反应完全逆转，说明将SRBC输入db/db小鼠引起的高血压反应可能与NO生物利用率降低有关。为了进一步研究究竟是储存RBC什么成分诱导db/db小鼠发生高血压反应，将SRBC上清液输入db/db小鼠之后，SBP明显升高。而将洗涤FRBC或者洗涤SRBC输入db/db小鼠后不发生高血压反应。说明是SRBC上清液中某种成分导致高血压反应。此外，将SRBC上清液中游离Hb氧化成高铁Hb（metHb）之后输入，完全消除了SRBC上清液输入引起的高血压反应。因为metHb不与NO发生加氧反应，说明输入SRBC后上清液中的游离Hb通过清除NO，降低NO生物利用率导致db/db小鼠高血压反应。与对照组和FRBC组相比，各组动物输入SRBC 2小时后血清中铁含量显著升高。而肝脏中非血红素结合铁含量各组之间没有显著差异。与对照组和FRBC组相比，输入SRBC 2小时后，血浆IL-6水平和肝脏中IL-6 mRNA表达明显升高，全身炎症反应增强。与对照组和FRBC组相比，输入SRBC 2小时后，肝脏中HO-1 mRNAh和hepcidin表达水平在WT、HFD和db/db小鼠中均显著升高。【结论】将储存RBC输入后在WT、HFD和db/db小鼠中引起显著的炎症反应和铁超载等不良发应；SRBC输入db/db小鼠后引起血管收缩反应是由于NO被SRBC上清液中的游离Hb清除、血管内NO生物利用率下降所致，补充外源性的NO能消除SRBC输入引起的高血压反应。实验三NO生物利用率对储存RBC复苏失血性休克小鼠的影响及其机制研究【目的】研究用储存RBC对失血性休克小鼠进行复苏的效果，探索NO生物利用率降低对大量输入储存RBC的影响和机制。【方法】将60只WT小鼠随机分成3组（n=20）:对照组（Control）与其它组动物接受相同的手术操作但不发生失血性休克；FRBC组动物抽血制作失血性休克模型，90分钟后用FRBC进行复苏；SRBC组动物失血性休克90分钟之后用SRBC进行复苏。将80只HFD小鼠随机分成4组（n=20）:对照组、FRBC组和SRBC组的设定同WT小鼠；SRBC+iNO组动物在SRBC复苏之前10分钟吸入80 ppm NO并持续2小时。每组10只动物用作生存率观察，其余动物在复苏后2小时处死，取血样和器官留作后续分析。【结果】HFD小鼠血压的基础值显著高于WT小鼠（P<0.001）。复苏后各组之间MAP没有明显差异。通过Kaplan-Meier生存曲线比较，FRBC或SRBC复苏对WT小鼠短期生存率（12小时）和长期生存率（7天）均没有显著差异（P=NS）。与WT小鼠相比，SRBC复苏的HFD小鼠长期生存率显著降低（0%比40%，P<0.05）。HFD小鼠中，SRBC复苏小鼠的短期生存率和长期生存率与FRBC组相比显著降低。吸入80ppm NO明显增加SRBC复苏HFD小鼠短期生存率（80%比30%，P＝0.014），而对长期生存率并没有明显改善。用FRBC或SRBC进行复苏对pH值和动脉血气没有显著影响。与FRBC复苏相比，SRBC复苏HFD小鼠的乳酸水平显著升高，SRBC复苏并复合吸入NO能显著降低血中乳酸水平。复苏2小时后，SRBC复苏的WT小鼠脾脏明显变黑增大，与FRBC复苏相比脾脏重量显著增加。SRBC复苏HFD小鼠脾脏重量有增加的趋势，但与FRBC复苏HFD小鼠相比没有统计学差异。其它个脏器的重量各组间无统计学差异。与各自对照组相比，失血性休克与复苏后AST、BUN和CPK水平在WT和HFD小鼠血浆中均显著升高。SRBC复苏的WT和HFD小鼠中AST、BUN和CPK水平比FRBC复苏WT和HFD小鼠明显增高。与WT小鼠相比，SRBC复苏HFD小鼠引起AST、BUN和CPK水平升高更为显著。吸入80 ppm NO显著抑制SRBC复苏HFD小鼠血浆中AST、BUN和CPK升高。SRBC复苏HFD小鼠2小时后血中2,3-DPG和P50水平与FRBC组相比显著降低，提示SRBC复苏小鼠生存率降低可能与RBC与氧亲和力增加，终末器官氧供不足有关。SRBC复苏使WT和HFD小鼠血浆中游离Hb和heme含量与对照组和FRBC小组相比显著增加。吸入NO使血浆游离Hb含量降低。游离Hb和heme的细胞毒性作用可能参与了SRBC复苏不良反应发生。WT小鼠，SRBC复苏2小时后血浆触珠蛋白（haptoglobin，Hp）和血红素结合蛋白（hemopexin，Hx）水平与对照组和FRBC组相比显著下降。而HFD小鼠中，FRBC，SRBC和SRBC+iNO组血浆Hp和Hx水平均降低。SRBC组动物复苏2小时后，血浆IL-6含量与组织IL-6 mRNA表达与对照和FRBC组相比显著升高。SRBC复苏过程中吸入80 ppm NO对IL-6水平升高没有明显抑制作用。肺和肝中TNFα和TF mRNA水平在WT小鼠各组中没有显著差异。HFD小鼠，与对照组比失血性休克和复苏组TNFα和TF mRNA水平显著升高，但各组之间无显著性差异。SRBC复苏使WT和HFD小鼠肺和肝脏中HO-1和hepdicinmRNA的表达与对照和FRBC组相比显著增加。【结论】储存RBC复苏失血性休克小鼠引起死亡率增加、器官功能障碍、全身炎症反应等不良反应。补充外源性的NO通过扩张局部微循环增加局部血流供应、减轻代谢性酸中毒、增加各器官血流灌注、改善器官功能提高储存RBC复苏动物的短期生存率，但对炎症反应和长期生存率的改善没有显著疗效。小结1.小鼠RBC体外储存2周后发生与储存6周的人RBC相似的储存损伤，表现为溶血、ATP, 2,3-DPG含量减少、RBC形态改变，变形能力丧失、回输后生存率降低等生理生化、形态结构和功能变化；2.将少量储存RBC回输给健康小鼠和高脂饮食诱导内皮功能障碍小鼠引起炎症反应和铁超载等不良反应，将SRBC输入自发糖尿病小鼠引起血管收缩血压升高等不良反应是由游离Hb清除血管内NO，导致NO生物利用率下降所致；3.将大量储存RBC输入对失血性休克WT和HFD小鼠进行复苏引起代谢性酸中毒、全身炎症反应、器官功能障碍、生存率下降等不良反应；4.通过动物实验摒除混杂因素的影响，本研究证实：RBC储存时间是RBC回输后不良反应发生的独立危险因素。与健康小鼠相比，存在内皮功能障碍小鼠对储存RBC输入引发的不良反应更为敏感，输入储存RBC后引发的不良反应更加严重；这项结果解释了临床试验仅在心血管疾病、创伤和重症患者等存在内皮功能障碍患者中发现RBC储存周期与临床不良反应的相关性的原因；5.储存RBC输入不良反应是多因素共同作用的结果，其中NO生物利用率的降低与血管收缩血压升高、器官功能障碍、生存率降低等不良反应相关。给予补充外源性NO虽然不能彻底消除，但能够预防和缓解部分不良反应的发生。将本研究结果外推至临床实践，当需要给内皮功能障碍或失血性休克患者大量输血时，条件允许的情况下应输入储存时间短的新鲜RBC；若需要输入储存RBC时，补充外源性NO增加NO生物利用率有助于降低不良反应的发生。