研究背景类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以滑膜炎为中心病理的自身免疫性疾病,属于中医痹证或历节的范畴,也是痹证中的代表性病种。《素问·痹论》所载:“风寒湿三气杂至,合而为痹也”,明确说明外界环境在痹病发病中的作用。现代研究表明,气温、湿度、风速等因素对RA活动度有重要作用。随着病因病机研究的发展和历代医家的临床总结,风寒湿痹、风湿热痹是早期及活动期的两个主要证型,前者以祛风散寒、除湿通络止痛为治则,代表方为乌头汤,后者以清热解毒、除湿活络止痛为治则,代表方为四妙丸。历代医家对痹病活动期治疗方案意见颇不一致,说明RA活动期可能表现为寒痹或热痹的规律复杂难辨。寒痹、热痹动物模型是探讨中医痹病的病因病机理论的重要实验载体,目前的寒痹或热痹动物模型大多数是通过在诱导性关节炎模型基础上施加环境因素刺激来制作的,然而,这种模型是否能真实代表中医痹病的“寒痹”与“热痹”证型本质及致病机制仍存在较大争议;并且鲜有对风寒湿、风湿热等外界环境的致病实质的报道。因此,研究RA寒痹、热痹病证结合动物模型及环境因素的致病实质对探讨中医痹症病因病机理论、研究中医方药药理作用环节都有重要意义。研究内容第一章 人工环境对人TNF-α转基因关节炎小鼠模型的影响目的观察人工风寒湿、风湿热环境刺激对人TNF-α转基因(Tgtc)关节炎小鼠模型的作用,探讨Tgtc小鼠的发病机制与缺氧诱导因子1α(HIF1α)和热休克蛋白70(HSP-70)的关系及痹证动物模型的病理实质,并制定评价痹证动物模型的客观量化指标。方法将27只SPF级雌性Tgtc小鼠、27只SPF级雌性FVB小鼠按随机数字表法分为空白对照(BC)组、风寒湿(FHS)组、风湿热(FSR)组,每组18只,分别以SPF环境、人工风寒湿环境、人工风湿热环境刺激,每天2次,每次2h,共刺激64h。观察测量各组踝关节直径、四肢关节变形指数、踝关节处皮肤颜色,环境刺激结束2周后进行双下肢激光散斑血流成像、血清HIF1α及HSP-70、踝关节组织病理及免疫组化等检测。结果FVB小鼠观察测量指标除FSR组血清HSP-70值下降外,其余指标均不受环境因素影响。Tgtc小鼠在人工环境刺激期间,FHS组踝关节处皮肤颜色暗红程度、踝关节直径、四肢关节变形指数较BC组高(P<0.05),而FSR组相反(P<0.05);结束环境刺激后,3组Tgtc小鼠踝关节皮肤颜色、踝关节直径、关节变形指数逐渐趋于一致,差异无统计学意义(P>0.05);FHS组踝关节及掌指关节处散斑流速指数(SFI值)较BC组的低(P<0.05),滑膜组织HIF1α表达量较BC组高(P<0.05),2组间血清HIF1α含量、滑膜组织HSP-70表达量比较差异无统计学意义(P>0.05);FSR组掌指关节处SFI值、滑膜组织及血清HSP-70表达量、血清HIF1α含量均较BC组高(P<0.05),滑膜组织中HIF1α表达量较BC组低(P<0.05);踝关节病理提示三组均有严重的滑膜成纤维细胞增生,伴有少量的炎症细胞浸润(P>0.05),但FSR组软骨层损伤深度、软骨表面损伤范围、软骨处炎症细胞浸润程度较BC组的低(P<0.05)。结论风寒湿热环境刺激能在一定程度上影响RA病证结合动物模型的中医症候。Tgtc小鼠属性为寒,持续FHS环境刺激时可作为寒痹模型,其发病实质与滑膜组织HIF1α上调有关;FSR刺激能上调血清及滑膜组织HSP-70,并对Tgtc小鼠骨质破坏进展有一定的延缓作用。寒痹动物模型的病理实质为滑膜成纤维细胞增生为主,伴少量炎症细胞浸润。关节SFI值、关节直径、皮肤颜色可作为评估痹证模型的客观量化指标。第二章 乌头汤及四妙散对Tgtc小鼠模型的作用研究目的探讨乌头汤、四妙丸对Tgtc小鼠模型的疗效,以反证法验证该小鼠模型的寒热属性。方法24只SPF级Tgtc小鼠按照随机数字表法分为空白对照(BC)组、乌头汤(WTT)组和四妙丸(SMW)组,每组8只,记录各组在给药期间的一般情况、四肢关节变形指数、踝关节直径、踝关节颜色,药物连续灌胃4周后进行双下肢激光散斑血流成像、双膝关节核磁共振(MRI)扫描及血清HIF 1α及HSP-70、踝关节组织病理及免疫组化等检测。结果经WTT灌胃处理后,小鼠四肢关节变形指数升高幅度、踝关节直径、踝关节皮肤红色值(a值)、踝关节SFI值、膝关节囊上积液量、滑膜组织HIF 1α表达量、滑膜组织微血管密度均较BC组低(P<0.05),血清及滑膜组织HSP-70表达量高于BC组(P<0.05);经SMW灌胃处理后,小鼠踝关节直径升高幅度较BC组强(P<0.05),四肢关节变形指数、踝关节SFI值较BC组低(P<0.05),滑膜组织HSP-70表达量较BC组高(P<0.05),踝关节皮肤颜色a值、膝关节囊上积液量、血清HSP-70含量、滑膜组织微血管密度与BC组比较差异无统计学意义(P>0.05);3组小鼠血清中HIF 1α含量比较差异无统计学意义(P>0.05);3组小鼠踝关节、膝关节病理见严重的滑膜成纤维细胞增生,伴有少量的炎症细胞浸润(P>0.05),但WTT组软骨层损伤深度、软骨表面损伤范围、软骨处炎症细胞浸润程度较BC组低(P<0.01),SMW组与BC组比较,软骨侵蚀评分差异无统计学意义(P>0.05)。结论WTT对Tgtc小鼠的疗效更好,Tgtc小鼠基础属性偏向寒。第三章 人工环境对胶原诱导性关节炎大鼠模型中医证型的影响及实质研究目的研究人工环境因素对CIA大鼠模型中医证型的影响,探讨CIA大鼠的发病机制与HIF1α和HSP-70的关系及痹证动物模型的病理实质。方法24只SPF级雌性SD大鼠按随机数字表法分为BC组、FHS组、FSR组,NC组,每组6只,对BC组、FHS组、FSR组进行CIA造模,加强免疫后进行环境干预,BC组与NC组、FHS组、FSR组分别接受SPF环境、人工FHS和FSR干预,每天2次,每次2h,总共64h。观察测量各组在研究过程中关节炎指数(AI),环境干预4周后进行双踝关节皮肤红色值(a值)、双踝关节X线、HIF1α与HSP-70等检测。结果FSR组AI值较BC组更快达到峰值、峰值维持时间长、下降幅度慢(P<0.05),FHS组AI值与之相反(P<0.05);FSR组a值、X线评分、血清及滑膜组织HSP-70含量均高于BC组(P<0.01),FHS组a值、X线评分较BC组差异无统计学意义(P>0.05),血清及滑膜组织HSP-70含量低于BC组(P<0.05);4组大鼠血清及滑膜组织不表达HIF1α,差异无统计学意义(P>0.05);踝关节病理提示3组CIA大鼠细胞增生以炎症细胞为主,FHS组大鼠病理评分较BC组低(P<0.05),FSR组大鼠病理血管翳增生明显、骨质破坏较严重,病理评分较BC组高(P<0.05)。结论CIA大鼠基础属性偏向热,经FSR刺激后具有显著的热痹证候演变过程,可作为热痹模型,病理实质为炎症细胞浸润,其实质与血清及滑膜组织HSP-70上调有关。全文小结环境刺激能在一定程度上影响RA病证结合动物模型的中医症候。Tgtc小鼠基础属性偏向寒,持续FHS环境刺激时可作为寒痹模型,其发病实质与滑膜组织HIF1α上调有关,其病理实质为滑膜成纤维细胞增生,伴少量炎症细胞浸润;FSR刺激能上调血清及滑膜组织HSP-70,并对Tgtc小鼠骨质破坏进展有一定的延缓作用。CIA大鼠基础属性偏向热,持续FSR环境刺激时可作为热痹模型,其发病实质与血清及滑膜组织HSP-70上调有关,其病理实质为炎症细胞浸润。使用激光散斑血流成像检测的关节SFI值、色差仪检测的皮肤颜色可作为评估痹证模型的客观量化指标。