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实验目的利用慢病毒沉默CD133基因探讨其对人肝癌CD133+-HepG2干细胞放射敏感性的影响。第一部分：CD133+-HepG2细胞的分选及“干性”鉴定实验方法：利用免疫磁珠分选技术从HepG2肝癌细胞系中分选出CD133+及CD133-细胞亚群,并用流式细胞术检测分选前后CD133的表达率；对分选得到的CD133+-HepG2肝癌细胞进行体外成球能力及NOD/SCID小鼠皮下成瘤能力检测,并取皮下移植瘤进行HE染色观察肿瘤组织结构；克隆形成试验对比CD133+细胞与CD133-细胞克隆形成能力。实验结果：从HepG2肝癌细胞系中利用免疫磁珠分选技术成功分选出CD133’与CD133-细胞,并用流式细胞术检测HepG2细胞的CD133基础表达率为(1.36±0.20)%,通过分选后CD133表达率上升到(87.62±1.92)%。随后无血清培养结果显示CD133+HepG2细胞能在含EGF、FGF、LIF的无血清培养液中能成球生长,而CD133--HepG2细胞则无法在相同的培养液中生存。小鼠皮下成瘤实验结果显示1×103个CD133+细胞即可在NOD/SCID小鼠皮下形成移植瘤,而相同条件下CD133细胞均也不能成瘤。HE染色结果显示,由CD133+细胞形成的皮下移植瘤在显微镜下组织细胞呈排列致密,细胞核清晰可见。平板克隆形成试验显示,CD133+细胞比CD133细胞具有更强的克隆形成能力,其克隆形成率为：35.03±2.35%,而CD133-细胞克隆形成率仅为：6.4±0.72%。两者具有显著差异,P<0.01。实验结论：上述实验结果表明通过免疫磁珠分选得到的CD133+-HepG2细胞比CD133--HepG2细胞具有更强的体外成球和体内成瘤能力及克隆形成能力,是具有肿瘤干细胞特性的肝癌细胞亚群。第二部分携带CD133干扰序列的慢病毒感染CD133+-HepG2实验方法：利用慢病毒介导的RNA干扰技术,以CD133基因为沉默靶点,按预实验得出的MOI值20对CD133+-HepG2肝癌细胞进行感染,以转染shCD133组为实验组、转染shNC组为阴性对照组,未处理的CD133+-HepG2细胞为空白对照组；3天后在荧光显微镜下观察慢病毒的感染效率；克隆形成实验检测三组细胞克隆形成能力；RT-PCR和Western Blot检测三组细胞CD133mRNA及蛋白的表达；实验结果：接种慢病毒后3天,在倒置荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白(GFP)的表达,第5天达到高峰,其感染阳性效率达80%以上；克隆形成实验结果显示沉默CD133后的CD133+肝癌干细胞增殖能力明显减弱(P<0.01)；RT-PCR和Western Blot结果显示慢病毒介导的CD133shRNA能有效下调CD133的mRNA和蛋白表达(P<0.01);实验结论：上述实验结果表明慢病毒介导的shRNA能显著下调CD133+肝癌干细胞CD133的表达,并能显著抑制其增殖能力。第三部分克隆形成实验检测各组细胞放射敏感性并探讨其可能机制。实验方法：采用克隆形成实验检测各组细胞克隆形成率(Plating efficiency PE), PE=克隆数目/接种细胞数×10096,以及存活分数(survival fraction SF), SF=受照射细胞的克隆形成率／对照组细胞克隆形成率×100%。绘制剂量存活曲线并计算放射生物学参数。利用流式细胞仪检测三组细胞细胞周期及凋亡情况。实验结果：阳性感染组的剂量存活曲线较其他两组整体下移。根据多靶单击模型计算出各组SF2、D0、Dq及N值结果表明,阳性感染组的PE、SF、SF2、D0、Dq及N值均较空白组和阴性感染组明显减小,其放射增敏比(SER)为：1.37±0.02。差异具有统计学差异,P<0.01。流式细胞术检测各组细胞周期及凋亡情况,结果发现阳性感染组其S期明显减少G2期增多,细胞凋亡也明显增加。差异有统计学意义P<0.05。实验结论：沉默CD133基因后,CD133+-HepG2细胞放射敏感性明显增强,细胞周期的改变与细胞凋亡率的增加是其可能的增敏机制。