第一部分:Golm1在肺纤维化中的作用及其机制探究研究背景:包括特发性肺纤维化（IPF）在内的纤维化型间质性肺疾病（简称肺纤维化）是一组病因和发病机制未明,但严重影响患者的生存和生活质量,为患者家庭以及社会带来沉重负担的疾病。IPF是一种慢性进行性的、致命的肺疾病。各种因素促成了 IPF的发展,如成纤维细胞的异常增殖、肌成纤维细胞的异常表达、肺上皮或内皮的损伤、组织的异常修复、伤口愈合途径的失调以及细胞外基质（ECM）生成过多和累积。然而,肺纤维化疾病机制复杂,有待进一步阐明。我们的研究旨在探索高尔基体膜蛋白1（Golgi membrane protein 1,Golm1）升高在肺纤维化中的意义以及探究其促进纤维化形成的机制。研究方法:我们首先通过GEO公共数据库分析了 Golm1在IPF患者以及对照肺组织和血清中的表达。其次,我们采集IPF患者和健康对照的血清,同时也收集了临床IPF患者以及供体对照的肺组织,分别通过ELISA,qRT-PCR,Western Blot和免疫组化对Golm1的表达进行了检测。随后,我们通过使用TGF-β1刺激细胞以及博来霉素诱导小鼠纤维化模型再次对Golm1的表达进行了检测。为了进一步探讨Golml升高在纤维化中的作用,我们利用慢病毒构建了稳定沉默Golm1和稳定过表达Golm1的细胞系,并通过Western Blot检测纤维化相关的蛋白,利用Transwell和CCK8分别对细胞的迁移和增殖能力进行了检测。此外,我们还构建了 Golm1基因全身过表达和全身敲除的小鼠,通过博来霉素诱导小鼠纤维化模型对纤维化相关指标进行了检测以探讨Golm1在纤维化中的作用。为了进一步探究Golm1促进纤维化的机制,我们对Golm1沉默和过表达细胞进行了全转录组测序,通过qPCR进行验证筛选出Golm1调控的基因lncRNA Neat1。并通过Western Blot,Transwell和CCK8对筛选出的基因进行了功能学的研究。最后通过GSEA数据库,ChIP等实验探讨了 Golm1如何正性调控Neat1从而促进纤维化的发生。研究结果:我们首先通过GEO公共数据库发现了高尔基体膜蛋白1（Golgi membrane protein 1,Golm1）在IPF患者的肺组织以及血液中明显升高。随后,收集的临床IPF肺移植患者的肺组织,以及患者的血清标本中进行的验证同样发现了 Golm1在IPF患者的肺组织和血清中的表达明显升高。通过一系列的功能实验对Golm1沉默和过表达的人和小鼠成纤维细胞进行的实验证实,Golm1不仅具有促进纤维化的作用,还能在纤维化发生期间协同TGF-β1,进一步加重纤维化的发生发展。通过博来霉素对Golm1全身过表达和全身敲除的基因型小鼠进行纤维化造模发现Golm1全身敲除的小鼠纤维化程度明显减轻,而Golm1全身过表达的小鼠纤维化程度明显的加重,同时小鼠的体重也明显降低,小鼠的生存率也明显的下降。为了进一步探讨Golm1是通过何种机制发挥促纤维化作用,我们对构建的Golm1稳定敲低和过表达的细胞系进行了全转录组基因测序（RNA-Seq）。通过对测序结果进行分析和验证,我们筛选到了 lnRNA Neat1可被Golm1正性调控,Golm1能够促进Neat1的表达从而促进纤维化的发生发展,随后我们进一步验证,发现Golm1能够通过负性调控转录因子Klf4,而Klf4能够与Neat1的启动子结合抑制它的转录。研究结论:本研究首次揭示了 Golm1在纤维化患者中明显升高;Golm1升高能够促进纤维化的发生发展;Golm1通过抑制Klf4的表达从而促进Neat1的转录促进纤维化的发生。第二部分:肺纤维化小鼠中自噬动态观察和转录组特征研究背景:特发性纤维化是一组致命的进行性纤维化肺部疾病,自噬在肺纤维化中的作用存在争议。我们的研究旨在探讨自噬在纤维化各个阶段中的作用以及了解其在各阶段中的变化。研究方法:在这项研究中,我们通过对小鼠气道内注射博来霉素诱导肺纤维化,分别在第3、7、14、21和28天处死小鼠,取肺组织,通过Western Blot对自噬标记物LC3B以及SQSTM1蛋白进行检测,通过电镜观察自噬小体,免疫荧光对LC3B的荧光斑点进行检测。随后,对博来霉素造模后不同天数的小鼠肺组织提取总RNA,并进行全转录组基因测序（RNA-Seq）、短时间序列表达探究（STEM）分析,以探索纤维化不同阶段和时间点相关基因的表达。通过基因本体功能（GO）以及KEGG信号途径对各阶段差异表达基因的功能和信号通路进行分析。同时,对转录组中自噬相关的基因通过热图进行分析比较,运用Western Blot对转录组测序中自噬相关的基因进行验证。最后,通过公共数据库,筛选对IPF患者以及小鼠肺纤维化动物模型的单细胞测序研究,并对不同类型细胞中的自噬相关基因的表达进行了分析。研究结果:我们发现在以上指定的时间点,肺纤维化小鼠的肺组织的自噬标志物未发生明显变化。随后,我们通过转录组测序（RNA-Seq）分析了博来霉素造模后不同时间点小鼠肺组织中的基因表达及相关功能和通路。我们还进行了短时间序列表达探究（STEM）分析,以探索纤维化不同阶段相关基因的表达。STEM分析持续上调或下调的相关基因显示,自噬相关基因在纤维化发展中未发挥持续的作用。此外,根据转录组测序得到的差异表达基因,对差异表达基因运用的GO功能富集分析以及KEGG信号途径分析显示,持续上调的基因谱主要与纤维化合成、细胞外基质以及炎症有关,而富集的信号途径主要与PI3K-AKT信号通路、ECM-受体相互作用和细胞粘附信号通路有关。对于持续下调的基因表达谱,GO功能主要涉及肌节组织、肌肉收缩和肌纤维发育。富集的KEGG信号通路是cAMP信号通路、cGMP-PKG信号通路、钙信号通路和心肌收缩相关途径。此外,我们从公共数据库中筛选了三项对于IPF患者肺组织单细胞测序研究和一项肺纤维化动物模型的研究,对各个不同类型细胞中自噬基因结果的分析均表明自噬在肺纤维化的发病机制中并没有呈现出一致的变化。研究结论:通过小鼠模型研究发现在不同阶段的肺纤维化发展过程中,自噬可能不会发生持续的变化。而通过RNA-Seq和STEM分析显示纤维化中这些持续上调或下调的基因谱,包括差异表达基因及其相应的功能和信号途径,可能为IPF治疗提供新的机制见解。