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植物不能像动物一样移动,所以在整个生长发育过程中会不断遭受各种各样的胁迫刺激。在长期的进化过程中,植物本身形成了一套精密而复杂的防御机制,其中转录调控系统及信号传递网络发挥了重要作用。WRKY转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,通过调控靶基因启动子区的W-box顺式作用元件调控靶基因的表达。基于基因组测序技术的不断完善,甜薯SPF1作为第一个WRKY转录因子被报道后,其他物种中WRKY家族成员被大量发现鉴定。通过对WRKY转录因子功能的研究发现WRKY转录因子在植物防御反应、非生物胁迫、生长发育及代谢过程中都发挥了重要作用。对WRKY转录因子的研究多集中在模式生物拟南芥、水稻中,在经济作物棉花中研究较少。可能基于I类WRKY转录因子是WRKY转录因子进化的祖先,对I类WRKY转录因子功能的研究要远少于对II类和III类WRKY转录因子的研究。因此,本研究以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)(鲁棉22)为材料,利用同源克隆的方法分离得到一个I类WRKY基因,命名为GhWRKY25,并对其进行生物学功能分析,具体研究结果如下:(1)基因全长序列分析表明,该基因cDNA全长为1798bp,包括75bp的5’非编码区(Untranslated region,UTR),172bp的3’UTR和1551bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF)。ORF编码一个516个氨基酸的多肽,预测其分子量大约为56.349kDa,pI值为8.47。对该基因编码的氨基酸序列进行同源比对及聚类分析,结果表明棉花GhWRKY25与CsWRKY4、JcWRKY6、GhWRKY3和TcWRKY3具有较高同源性,且这些基因都属于I类WRKY转录因子。对基因组DNA序列分析发现,GhWRKY25基因组DNA含有3个内含子,且第一个内含子的插入位点符合I类WRKY转录因子的保守插入位点。以上结果表明,本研究分离得到的是棉花I类WRKY转录因子,并命名为GhWRKY25。(2)采用反向PCR的方法分离得到792bp的GhWRKY25的启动子序列。利用在线软件PlantCARE分析,表明该启动子序列上含有与低温、干旱、胚乳及赤霉素相关的顺式作用元件,说明GhWRKY25可能具有多样化功能。(3)采用RT-PCR的方法对Gh WRKY25基因在棉花受到不同胁迫时的表达特性进行了研究。结果表明,GhWRKY25的转录水平受高盐和低温(4?C)诱导,受聚乙二醇(PEG)和机械损伤抑制;激素信号分子GA3、6-BA、ABA和SA可强烈诱导GhWRKY25基因的表达,但是GhWRKY25的转录水平基本不受ET和MeJA影响。以上结果表明GhWRKY25可能参与不同的信号途径,在植物生长发育及胁迫应答过程中发挥重要作用。(4)构建35s-ghwrky25::gfp融和表达载体,采用基因枪转化法瞬时转化洋葱表皮细胞,利用荧光显微镜观察gfp荧光,发现空gfp对照载体在细胞质和细胞核中均有荧光,但是融和载体只在细胞核中有荧光,说明ghwrky25定位在细胞核中,是典型的wrky转录因子。(5)为研究ghwrky25的功能,构建ghwrky25与正义植物表达载体pbi121的重组载体pbi121-ghwrky25,采用农杆菌介导法转化本生烟(nicotianabenthamiana)。通过扩增部分camv35s启动子序列鉴定阳性植株。对部分转基因本生烟进行rt-pcr分析,选取ghwrky25表达量高、中、低的三个株系用于功能分析实验。干旱胁迫处理后,与野生型本生烟相比,转基因植株降低了对干旱胁迫的抗性:在含200mm甘露醇的ms培养基上培养7d后,转基因烟草种子的萌发率比野生型种子低10%-20%;萌发后转基因幼苗在含200mm甘露醇的ms培养基上培养14d后,根长比野生型幼苗短5-8mm;干旱处理营养生长期植株后,转基因植株的存活率比野生型植株低30%-40%,叶片含水量低15%-20%,蒸腾水损失速率高10%-15%。综合以上结果表明超表达ghwrky25降低了干旱胁迫抗性。(6)干旱处理后,超表达ghwrky25的转基因植株中h2o2和o2.-含量增加,与ros产生相关的基因的表达量增加,与ros清除相关基因的表达量降低,各种抗氧化酶的活性降低。以上结果表明,ghwrky25参与了ros信号途径。(7)超表达ghwrky25的转基因植株提高了对高盐胁迫的抗性:在含200mmnacl的ms培养基上培养7天后,转基因种子的萌发率比野生型高20%-30%;萌发后的转基因幼苗在含200mmnacl的ms培养基上培养14天后根长比野生型长5-10mm;转基因和野生型烟草的叶圆片在不同浓度nacl水溶液中处理72h后,野生型叶圆片严重褪绿卷曲,转基因叶圆片症状较轻。以上结果说明ghwrky25可能正调控高盐胁迫抗性。(8)超表达ghwrky25的转基因植株降低了对灰霉菌的抗性:灰霉菌处理3d后,转基因植株离体叶片菌丝生长更旺盛,菌斑直径比野生型离体叶片大5-12mm,叶绿素含量低于野生型离体叶片;与野生型植株相比,灰霉菌处理后转基因植株中与sa信号途径相关的pr基因的表达量降低,与ja信号途径相关的pr基因的表达量增加,与et信号途径相关的pr基因的表达量也降低。以上结果表明,ghwrky25可能通过sa-,ja-和et-介导的信号途径的综合作用降低了对灰霉菌的抗性。综上所述,ghwrky25提高了转基因植株盐胁迫的抗性,对干旱胁迫及生物胁迫的敏感性,这些研究结果对于进一步了解I类WRKY转录因子的功能提供了理论基础,同时也为研究棉花抗逆及抗病新品种提供了依据。