背景:哺乳动物配子受精前,其基因组处于无转录活性状态;经过减数分裂形成的卵子和精子在受精过程后相互识别并结合,遗传物质融合并形成合子,进一步发育成新的个体。受精卵基因表达受到合子基因组激活(ZGA)的调控,此前转录沉默的基因组进行重编程,建立其特有的全能性,并进一步激活早期胚胎发育所需的基因表达。ZGA是细胞核重编程的过程,可使合子基因组从受精时的转录沉默状态转变为后期的激活状态,合子基因的表达产物能够逐渐替代卵母细胞中贮存的母源因子维持早期胚胎发育,是哺乳动物及其他脊椎动物早期胚胎发育的关键阶段。不同物种ZGA的发生时间不同,在小鼠中ZGA开始于2细胞期,而人类则为4-8细胞期。这个合子发育过程中基因表达模式的剧变均发生在转录和翻译水平,基因组激活的差异可能导致的不同结果,并对哺乳动物的妊娠结局产生一定影响。根据功能和转录活性可将ZGA分为次要和主要两个阶段:起始阶段即次要ZGA,发生在1细胞胚胎期的S相到2细胞期的G1相,为缓慢发育阶段;而主要ZGA发生在2细胞晚期,大量转录过程快速发生,基因调控机制开始运行。两个阶段的正确激活和调节对于基因的表达至关重要,并在细胞增殖和早期胚胎发育中发挥关键作用。由于次要ZGA阶段产物中转录活性相对较低,并存在大量的无效剪切,而且其在2细胞期后的胚胎发育过程中的作用仍需要进一步研究;相反,主要ZGA在2细胞期后胚胎发育中所发挥的作用较为明确,其功能异常可导致胚胎发育停滞于2细胞期。因此,ZGA异常不仅会影响基因表达,还可导致早期胚胎发育停滞。主要ZGA阶段发生的基因表达重编程对于后续的早期胚胎发育至关重要,异常可致与早期胚胎发育相关基因表达数目下调,胚胎质量受损以及不孕的发生。现已发现多个与ZGA相关的基因及母源蛋白,主要有YAP1、TLE6、BTG4、MED13和OCT4等,但小鼠体内与ZGA直接相关的RNA结合母源因子的作用尚不明确。本文中我们主要的研究对象是母源RNA结合蛋白,胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2(IGF2BP2,又称IMP2)。IMP2属于RNA结合蛋白家族,在小鼠和其他动物的卵母细胞、胚胎和性腺中大量表达,已有研究证实其在癌细胞、2型糖尿病等疾病或细胞代谢、翻译起始等生物学过程中发挥重要作用,但是尚无有关IMP2在小鼠ZGA及早期胚胎发育中作用的研究。在过去的40多年中,人类辅助生殖技术(ART)广泛应用,但如何提高胚胎种植率和妊娠率仍是较大挑战,因此越来越多的研究旨在完善胚胎培养策略(尤其是受精到移植的阶段)。由于体外胚胎培养与胚胎的早期发育及其种植率密切相关,因此优化体外培养方案是改善辅助生殖技术妊娠结局的关键因素之一。胚胎体内和体外培养之间发育潜能有差异的主要原因可能是体外培养缺乏特定的卵母细胞及胚胎相关的生长因子。尽管与女性生殖有关的生长因子已得到广泛研究,但是临床应用时体外胚胎培养液中并未添加充足的胚胎发育所必需的生长因子,可能进一步导致早期胚胎生长发育受限、胚胎种植失败等,最终致不良妊娠结局的发生。胰岛素样生长因子2(IGF2)是所有已知生殖相关生长因子中最为复杂的调节因子,并可能是人类卵泡中的存在的主要生长因子,已有研究表明其在猪卵母细胞减数分裂成熟中具有促进作用,但是IGF2在早期胚胎发育中的作用及机制仍有待进一步研究。方法:Imp2基因敲除小鼠的构建及动物实验均符合山东大学伦理委员会对动物实验的相关要求和规定,本研究所使用的小鼠为ICR和C57BL/6J杂交遗传背景的Imp2敲除小鼠。首先,为构建Imp2基因敲除小鼠,将loxP位点引入Imp2的第3个和第4个外显子两侧,后将Imp2flox/flox小鼠与Vasa-Cre转基因小鼠杂交以获得Imp2flox/+,再次杂交获得敲除Imp2的小鼠,其中Vasa-Cre小鼠也称为Ddx4-Cre小鼠,是生殖细胞特异性表达Cre的工具鼠。基因敲除小鼠模型构建成功后,向24-28日龄对照组野生型雌性小鼠和Imp2基因敲除的雌性小鼠体内注射孕马血清促性腺激素(PMSG)及人绒毛膜促性腺激素(hCG)进行超数排卵,分别收集两组小鼠的卵母细胞和胚胎,在M16培养液中进行体外培养,以观察其胚胎的早期发育能力;并评估Imp2基因敲除小鼠及对照组小鼠在6个月内的产仔总数,以测试Imp2基因敲除小鼠生育力。借助RNA测序和定量蛋白质组学分析,观察比较Imp2基因敲除小鼠与对照组小鼠2细胞期胚胎的基因表达情况;运用蛋白质印迹实验、免疫组化和共聚焦显微镜成像等技术分析比较Imp2敲除小鼠及对照组小鼠卵母细胞和胚胎中相关蛋白质的表达情况。进一步利用实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)技术分析Imp2基因敲除小鼠卵母细胞和胚胎中下调基因的基因表达情况。运用细胞培养、质粒转染和荧光素酶测定法等探究IMP2与IGF2的关系以及样本中下调的IMP2结合基因的表达情况,并研究对照组和Imp2敲除小鼠的2细胞期胚胎翻译和转录差异的机制。除此之外,我们将对照组和Imp2敲除小鼠卵母细胞取出后进行体外受精及培养,并向受精后的胚胎培养液中添加浓度为50nM的IGF2,以探究其对早期胚胎发育的影响;随后将IGF2处理及对照组胚胎移植入假孕雌鼠体内,用以研究IGF2处理对胚胎体内发育情况的影响。结果:通过对卵母细胞及胚胎中IMP2表达情况检测我们发现,IMP2在不同发育阶段的卵母细胞和胚胎中均有表达,但表达量存在差异。小鼠胚胎中Imp2对于卵泡形成、卵母细胞减数分裂成熟及胚胎发育必不可少。在体外培养环境中,Imp2敲除小鼠的卵母细胞受精后大多数受精卵停滞在2细胞期,只有少数胚胎(6%)发育到4细胞阶段。对小鼠2细胞期胚胎进行转录组学和蛋白质组学分析显示,IMP2的缺失下调了 RNA结合及蛋白质结合的相关基因,而这些基因对早期胚胎发育的至关重要。蛋白质印迹实验和qRT-PCR实验结果进一步证明,Imp2基因敲除小鼠的2细胞期胚胎中,前述下调的基因表达量确有所降低。根据相关下调基因的mRNA表达情况以及荧光素酶活性测定结果,我们确定了Imp2的两个靶基因,Ccar1和Rps14。Ccar1及Rps14均为早期胚胎发育所必需,在野生型小鼠胚胎中Ccar1和Rps14缺失会导致胚胎发育停滞在不同阶段,主要停在2细胞期胚胎,且胚胎的发生也有一定程度的损伤。同时,Imp2敲除小鼠早期胚胎中基因转录及翻译受损,与对照组胚胎相比,Imp2敲除小鼠中获得的2细胞期胚胎的总RNA和总蛋白质合成减少了 2倍。此外,IGF2是IMP2的靶分子,向野生型胚胎的培养液中添加50 nM IGF2后,可使其囊胚率由对照组的29%提高至65%;然而向Imp2基因敲除胚胎的培养液中添加50 nM IGF2则对其早期发育无影响,大部分胚胎仍停滞在2细胞期。胚胎移植结果表明,向假孕小鼠体内移植经过50nM IGF2处理的早期胚胎,与移植对照组胚胎的小鼠相比,妊娠率及产仔数量均明显升高。萤光素酶测定实验结果证明,IMP2可与IGF2的5’端的非翻译区结合,通过添加IGF2可以提高下调基因的翻译活性,作用呈剂量依赖性。用ELISA法测定卵母细胞、胚胎及其培养液中的IGF2含量结果显示,Imp2敲除小鼠与对照小鼠相比IGF2水平降低2倍。最后,我们还收集了临床废弃的未成熟捐赠GV期卵母细胞,进行体外培养及受精,将正常受精的双原核(2PN)受精卵随机分为处理组与对照组,向处理组培养液中添加50nM IGF2,结果显示处理组的囊胚率较对照组有明显升高。此外,我们还发现与对照组相比,IGF2处理组胚胎评分也有显著提高。结论:通过研究,我们发现并证明了小鼠体内RNA结合蛋白IMP2在合子基因组激活及胚胎植入前的早期胚胎发育过程中有重要作用。IMP2可以上调合子基因组激活时重要相关基因的表达,缺失时主要导致胚胎停滞在2细胞期,最终可导致小鼠的胚胎异常,进一步影响妊娠结局。此外,我们的研究结果还揭示了生长因子IGF2在胚胎发育及动物生物技术和人类辅助生殖技术等方面的应用价值及前景。