【摘 要】
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蛋白质糖基化与蛋白多种生物学功能密切相关,异常蛋白质糖基化与多种癌症发生相关,具体表现为在癌症组织中出现独特的N-连接聚糖及N-连接糖蛋白。膀胱癌是发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤,是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一。针对临床病例的膀胱癌糖链相关研究较少,无法全面了解膀胱癌组织的糖链信息。深度糖组学分析,不仅为未来临床检测提供癌症候选标志物,还对了解膀胱癌的发生与发展机理研究有指导作用。而采用FFPE组织切片
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蛋白质糖基化与蛋白多种生物学功能密切相关,异常蛋白质糖基化与多种癌症发生相关,具体表现为在癌症组织中出现独特的N-连接聚糖及N-连接糖蛋白。膀胱癌是发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤,是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一。针对临床病例的膀胱癌糖链相关研究较少,无法全面了解膀胱癌组织的糖链信息。深度糖组学分析,不仅为未来临床检测提供癌症候选标志物,还对了解膀胱癌的发生与发展机理研究有指导作用。而采用FFPE组织切片作为研究材料的糖组学及糖蛋白组学技术也在不断发展中,这让我们有机会从FFPE组织切片对膀胱癌进行深度糖组学分析。为了研究膀胱癌FFPE组织切片的的N-连接聚糖,本论文发展了一种基于FFPE组织切片原位提取N-连接聚糖并进行质谱分析的方法:FFPE组织切片经脱石蜡、复水化和抗原修复后,通过PNGase F酶切FFPE组织解并释放N-连接聚糖,除盐后经泛甲基化修饰的N-连接聚糖,MALDI-TOF/TOF-MS检测N-连接聚糖并解析谱图。经定量分析获得肿瘤组织中显著差异的N连接聚糖,并经受试者工作特征曲线分析显示,在16例膀胱癌患者的肿瘤和癌旁组织发现肿瘤组织中蛋白质高甘露糖型N2H6,N2H7,N2H8,N2H9和复杂型N5H6F1的N-连接聚糖修饰水平显著上升;同时高甘露糖型N2H5,杂合型N3H5以及复杂型N3H4,N4H4,N5H6F1S2的N-连接聚糖修饰水平显著下降;且双天线型N-连接聚糖N3H4和N4H4单独或者共同区分膀胱癌患者肿瘤组织和癌旁组织都具有很好的可靠性,可能成为膀胱癌的潜在生物标志物。为了更深入的研究膀胱癌中糖蛋白质表达差异,本论文进一步研究了基于膀胱癌FFPE组织切片的的N-连接糖蛋白质组差异,发展了基于FFPE组织切片原位提取N-连接糖蛋白和质谱分析方法:FFPE组织切片经脱石蜡、复水化和抗原修复后,胰蛋白酶酶解组织原位释放的多肽,除盐后TMT标记肿瘤和癌旁切片样本肽段,除盐后MAX柱富集糖肽,然后用LCMS/MS检测N-连接糖蛋白并进行数据分析。N-连接糖蛋白数据显示,共鉴定到230种N-连接糖蛋白,其中约一半定位于细胞外区域、细胞外空间等;上下调糖蛋白数据分析与之前研究趋势相符;且发现在纤连蛋白等与癌症发展密切相关的蛋白存在糖基化位点特异性。综上所述,我们建立了一种基于膀胱癌FFPE组织切片的糖组学和糖蛋白组学的分析方法,并且发现了肿瘤组织中蛋白质的异常N-糖基化修饰,其中N-连接聚糖N3H4和N4H4或可成为膀胱癌的潜在生物标志物。此外,N-糖蛋白发现了如纤连蛋白等与癌症发展密切相关的蛋白存在糖基化位点特异性。
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