随着单分子、单颗粒和单细胞研究的深入发展,化学研究的对象逐渐从宏观均相体系推进到了微观异质体系。暗场显微镜正是支撑这种微纳尺度化学成像研究的重要技术手段之一。暗场显微镜对样本的瑞利散射信号进行成像,它利用斜照明的方式避免了入射光的千扰,具有优异的信背比。在所获得的光学图像中,有样本的区域具有较强的散射强度,没有样本的地方则表现为较暗的背景。暗场显微镜因此而得名。近二十年来,单颗粒暗场成像最典型的研究对象一直是银和金等贵金属纳米材料,其原因是多方面的。首先,贵金属纳米材料的局域表面等离激元共振效应(LSPR)使其具有显著增强的散射截面,因此容易探测。常规的暗场显微镜能够很容易地对粒径在30-40 nm的贵金属进行单颗粒成像。经过一定的光学系统优化,检测能力能够提升到10 nm以下。其次,LSPR效应使得纳米颗粒具有特征的散射谱峰。而且散射光谱包含了单颗粒的化学组成、几何形貌、表面状态和介电环境等丰富信息,具有重要的研究价值。因此,基于贵金属的单颗粒暗场成像技术在纳米光子学、光学传感、纳米电化学、细胞成像等领域得到了广泛深入的应用与发展。然而,目前暗场显微镜仍存在诸多有待改进和完善之处。第一,由于时间分辨率相对较低,单颗粒暗场显微镜极少用于快速过程的动力学分析。通常情况下,暗场显微镜将散射光谱作为最主要的定性和定量分析标准。光栅型成像光谱仪采集一条光谱的时间在数百毫秒至数秒的水平,难以满足微秒尺度反应动力学研究的需要。第二,几乎所有的单颗粒暗场散射研究都是以贵金属纳米材料为研究对象,极大限制了暗场显微镜的应用范围。正是由于以上的技术局限,近年来,单颗粒暗场成像的研究进展有所放缓。基于上述认识,本论文搭建了一台波长可调、微秒时间分辨率的单色型暗场显微镜。利用这一新型装置,本论文在1 Hz-30 kHz的频率范围内测定了单颗粒的非法拉第电化学阻抗谱,首次将单颗粒电化学研究从传统的电势扫描模式拓展到了高频交流调制模式,为基于阻抗分析的单颗粒传感奠定了基础。此外,将光学超定位算法和傅里叶变换策略引入单颗粒电化学研究中,发现了单个金属纳米颗粒的光学散射中心反映的是其电子态密度的中心,而非通常认为的几何中心。最后,利用纯吸收材料的共振瑞利散射效应研究了单个普鲁士蓝纳米粒子的散射光谱在电化学氧化还原过程中的变化规律,将暗场显微镜的研究对象从传统的贵金属纳米材料扩展到以无机配位化合物为代表的光吸收型纳米材料体系,为单颗粒暗场成像技术注入了新的活力。本论文的具体研究内容概述如下:1.单色型暗场显微镜研制传统的单颗粒暗场显微镜多采用白光光源照明、光栅型光谱成像的方式,测量单颗粒的散射光谱。较低的时间分辨率使其不适用于快速电化学过程的研究。我们搭建了一台单色型暗场显微镜,通过扫描激发光源的波长实现光谱采集;同时,通过单点探测器测量散射强度,将时间分辨率提高到微秒水平。本论文以单个金纳米棒为研究对象,评估了该装置的成像性能。结果表明,这一新型装置具有优异的暗场成像质量,光学系统稳定性较好。在单颗粒纳米电化学研究中,该装置将单个金纳米棒对电压的响应灵敏度提升至-10 mV,比传统光谱型暗场显微镜得到的-100 mV提高了一个数量级。2.单颗粒电化学阻抗谱测定利用搭建的单色型暗场显微镜,本论文首次测定了单颗粒的电化学阻抗谱。通过对电化学系统施加一定频率的正弦调制电压,引起单个金纳米棒内电子密度的周期性变化,表现为单色光照明下散射强度的周期性变化。在1 Hz-30 kHz的范围内逐步改变调制频率,将单个金纳米棒散射强度的振幅和相位对频率作图即可得到该单颗粒的非法拉第电化学阻抗谱。通过对阻抗谱的解析,本论文揭示了单颗粒的非法拉第充电和放电过程在低频区域(<100 Hz)受到电解质中离子迁移的影响。在高频区域(>100 Hz),非法拉第充电和放电才是一个纯的、不受到电解质影响的双电层过程。在此基础上,本论文计算得到单个金纳米棒表面电容为36.6±11.8 μF/cm2,更接近于金的真实电容。单颗粒的电化学阻抗谱不仅有助于深入理解纳米级界面的双电层效应,而且还为基于阻抗原理的单颗粒传感分析奠定了基础。3.单颗粒充放电过程中的光学散射中心移动在暗场显微镜的像平面上,单颗粒的瑞利散射汇聚为一个强度服从二维高斯分布的圆点,其半高宽(FWHM)约300 nm。通常认为,经过超定位算法分析以后,该圆点的中心(称为“光学散射中心”)反映了其几何质心。本论文将傅里叶变换和超定位算法相结合,追踪了单颗粒的光学散射中心在周期性充放电过程中的迁移路径。傅里叶变换的引入使得检测灵敏度达到0.1 nm,比传统光学质心追踪方法的检测灵敏度提高了数十倍。研究发现,在非法拉第充电过程中,随着电子注入,电子在单个纳米粒子表面的不均匀分布引起了光学散射中心的移动。数十个单颗粒的平均位移约为0.4 nm,移动的方向与其几何长轴方向没有相关性。这一结果表明,单颗粒的光学散射中心实际上反映的是其电子密度的中心,而非几何质心。此项研究不仅为研究亚纳米粒子水平上光子与电子之间相互作用提供了新的视角,而且还为其它一些快速、可逆的化学反应提供了一种高灵敏研究策略。4.单个普鲁士蓝纳米粒子的共振瑞利散射光谱根据普鲁士蓝纳米材料的光吸收性质,本论文利用暗场显微镜研究了单个普鲁士蓝纳米颗粒的共振瑞利散射光谱。研究发现,单个普鲁士蓝纳米粒子在水溶液中散射红光,其最大散射波长与其吸收波长相一致。与贵金属纳米材料的LSPR效应相似,共振瑞利散射受到周围环境介质折射率的影响。随着折射率增加,散射强度减弱,光谱发生蓝移。本论文进一步实时、原位研究了单个普鲁士蓝纳米粒子的电化学氧化还原过程。结果表明,在还原过程中,散射强度逐渐降低;在氧化过程中,它的散射强度逐渐增加,具有可逆性。此项研究以普鲁士蓝这一典型的无机配合物材料为例,将共振瑞利散射原理引入单颗粒暗场成像,拓宽了暗场显微镜的研究对象,对于推动暗场显微镜在单颗粒测量与成像中的应用具有重要意义。综上所述,从单颗粒暗场成像的技术角度来看:])本论文所研制单色型暗场显微镜具有微秒级的时间分辨率,特别适用于快速反应动力学的研究;2)创新性地将超定位方法和傅里叶变换结合起来,不仅提高了光学质心分析方法的灵敏度,而且还为暗场成像提供了一种新分析技术;3)首次将共振瑞利散射原理引入单颗粒暗场成像,拓宽了暗场显微镜的应用领域。从纳米电化学的科学角度来看,本论文建立了单颗粒电化学阻抗谱的理论模型,拓展了单颗粒电化学的研究模式,有望发展成为一种新颖的单颗粒生化传感策略。此外,所揭示的光学散射中心与电子密度分布之间的关联性也加深了人们对LSPR效应中光子与电子相互作用的认识。