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课题组前期利用转录因子活性谱芯片发现,原代培养的新生大鼠心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia reperfusion,H/R)后可引起核转录因子E47活性明显上调。E47通过形成同源或异源二聚体,结合于目的基因上游启动子的顺式作用元件E-box调节基因表达。文献报道,E47在上皮间质转型(epithelial mesenchymal transition,EMT)中起着重要的介导作用。与EMT密切相关的2个基因—上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)和α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)的上游启动子中都含有E-box顺式作用元件;E47可与之结合,上调α-SMA的表达,并下调钙粘蛋白的表达,使上皮细胞的表型发生变化,失去上皮细胞特征(如上皮细胞钙粘蛋白表达减少)和获得肌纤维母细胞样表型(如重新表达α-SMA)。E47在心肌细胞H/R过程中活性增高,是否也会诱导心肌细胞的α-SMA表达,从而促进心肌细胞获得肌纤维母细胞样表型,在心肌纤维化中起重要作用呢? 目的: 初步探讨心肌细胞H/R对转录因子E47表达的影响以及对心肌细胞表型的影响。 方法: 1.采用差速贴壁法体外培养Sprague-Dawly大鼠原代新生乳鼠心肌细胞及H9c2大鼠心肌细胞株。 2.Western-blot法测定心肌细胞E47、α-SMA、缝隙连接蛋白connexin 43、横纹肌肌动蛋白(αsacomeric actin,α-SCA)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)的蛋白表达水平及缺氧/复氧(H/R)后蛋白的变化。 3.Real-time PCR方法检测心肌细胞中E47和α-SMAmRNA的表达水平及H/R后mRNA的变化。 4.免疫细胞化学法观察H/R前后α-SMA在细胞中的表达部位及变化。 5.E47的RNAi实验。 结果: 1.E47蛋白及mRNA表达水平在原代心肌细胞和H9c2H/R后均出现表达增高现象,以H3/R1时间点表达最高,此后随着复氧时间的延长E47表达逐渐降低。 2.在原代心肌细胞,α-SMA蛋白及mRNA表达水平在H/R后出现上调,在所观察的最长8h的复氧时间中,呈现随复氧时间延长而逐渐增高的趋势;在心肌细胞株上,α-SMA蛋白表达呈现类似结果。 3.细胞免疫组化结果显示,H9c2H3/R1组与正常组及阴性对照组比较,细胞浆中棕染的α-SMA明显增强。 4.在H9c2H/R后,connexin43、α-SCA、cTnT蛋白表达均下调,在所观察的最长8h的复氧时间中,呈现随复氧时间延长而逐渐下降的趋势。 5.RNAi实验因转染效率过低,未得到阳性结果。 结论: 心肌细胞H/R后E47高表达,connexin43、α-SCA、cTnT蛋白表达均下调,α-SMA的表达上调,心肌细胞的基因表达谱改变,获得肌纤维母细胞表型。