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研究目的1通过随机对照的方法,研究通冠胶囊在冠心病患者冠脉介入(percutaneous coronary intervention, PCI)术后改善患者生命质量的作用,并探讨其可能机制。2建立大鼠颈动脉内膜损伤模型,观察通冠胶囊动员骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)修复损伤血管内膜的作用。研究方法1临床研究选择符合纳入标准的冠心病PCI术后的患者60例,随机数字法分为对照组(冠心病基础用药+安慰剂)和治疗组(冠心病基础用药+通冠胶囊),每组各30例,入选病例于手术日开始服用通冠胶囊或安慰剂3粒,一日三次,连续3月。观察指标：(1)各组一般情况(性别、年龄、既往史及危险因素等)、PCI结果(支架置入的位置及个数)；(2)流式细胞仪检测患者支架植入前和术后口服通冠胶囊1个月后外周血的CD34和VEGFR2双阳性的细胞(即EPCs)数目的百分比；(3)术前及术后3月行心脏超声检查,检测左室功能以及室壁运动指数的变化；(4)术后随访3个月,观察两组患者主要不良心血管事件的发生率。2实验研究选用近交系的雄性Wistar大鼠32只,SPF级,体重180-220g。普通饮食,适应性喂养1周后,10只大鼠作为供体,提取其骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells, BMMNCs),培养诱导分化为EPCs,双染鉴定后,用红色细胞膜荧光染料PKH26进行标记,调整密度为2×107个/ml。球囊拉脱法建立大鼠左侧颈动脉内膜损伤模型后24h内,经尾静脉移植EPCs,每只0.3ml。之后随机分为通冠胶囊组(600mg/kg/d)和盐水对照组(生理盐水10ml/kg/d),每组为11只,连续灌胃4周。之后处死大鼠,心脏采血,室温下放置1小时,离心后取血清,-80℃冰箱储存备用；取损伤颈总动脉,制作冰冻切片,每张5μm,每个标本随机切5张。观察指标：(1)颈动脉损伤后即刻、1周后,1%的Evans blue 2ml经尾静脉注射,心脏灌流处死大鼠(每组3只),取出损伤的颈总动脉长约1cm,血管纵向切开,平铺固定,测量再生内膜面积与损伤总面积之比；(2)冰冻切片行HE染色及弹力纤维染色后光镜下观察管壁增生情况,计算机图像分析内、中膜面积及其比值(intima area/media area, IA/MA),观察通冠胶囊对增生内膜形成的影响, (3)荧光显微镜下观察PKH26标记的骨髓内皮祖细胞在损伤动脉内膜处的表达,参与修复损伤血管内膜的情况；(4)药物干预后,Elisa法检测两组大鼠血清中基质细胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1, SDF-1).血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的浓度,探讨通冠胶囊加快损伤血管内膜修复的可能作用机制。研究结果1临床研究1.1术前比较两组患者的一般情况和PCI情况,差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者具有可比性。1.2术前两组患者的LVEF和室壁运动积分无统计学差异(均P>0.05)；术后3个月,两组的LVEF及室壁运动积分较术前改善,说明PCI术后可以改善患者的心脏功能；与对照组相比,通冠胶囊组可进一步改善患者的左室功能及室壁运动积分(P<0.05),说明通冠胶囊能够进一步改善患者术后的心脏功能。1.3治疗前通冠胶囊组和安慰剂组的内皮祖细胞数量均较低,差异无统计学意义(P=0.16),两组术后30天较术前外周血中CD34和VEGFR2双阳性细胞百分比均有所上升(P<0.05),但通冠胶囊组外周血CD34和VEGFR2双阳性细胞水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。说明通冠胶囊可以动员骨髓内皮祖细胞进入循环血中,进而参与损伤血管内膜的修复。1.4对照组有1例因重症左心功能不全,于术后4周死亡；两组患者在观察时间内均无靶血管血运重建。对照组新发的心功能衰竭发生率明显高于治疗组(P=0.045)；两组主要心血管事件发生率比较,治疗组为6.7%,对照组为33.3%,治疗组明显低于对照组(P=0.024)。2实验研究2.1提取大鼠的骨髓单个核细胞经过条件培养基诱导培养,七天后可成功分化为内皮祖细胞,荧光显微镜下可以观察到内皮祖细胞吞噬Dil标记的去乙酰化的低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein, Dil-acLDL)和FITC标记的荆豆异凝素(acetylated low density lipoprotein, FITC-UEA-1),分别显示红色和绿色荧光,证明诱导培养成功。2.2再内膜化面积：通冠胶囊组和盐水组在内膜损伤的总面积上无差异,1周后治疗组在再生内膜面积、再生内膜面积和总面积的比值均明显高于对照组(P<0.05))说明通冠胶囊可以加速损伤血管内膜的再内皮化。2.3组织学观察：球囊损伤后,可见动脉内皮剥脱,个别处内弹力板破裂,内弹力板由正常时的波浪状变平坦,失去弹性。两组在球囊损伤后4周,内膜增生明显,但治疗组较对照组增生显著减少(P<0.01)、IA/MA较对照组明显降低(P<0.01)。证明通冠胶囊可以减少损伤血管内膜和中膜的增生,为PCI术后再狭窄的防治提供了理论依据。2.4 4周后通冠胶囊组颈动脉切片内膜处有红色荧光表达,形成完整血管内膜；而对照组血管切片仅有散在荧光光点。说明EPCs分化为内皮细胞,修复损伤血管内膜。2.5 VEGF、SDF-1酶联免疫吸附法检测：通冠胶囊组与对照组比较,术后2周、4周时差异均有显著性意义(P<0.01)。说明通冠胶囊动员骨髓内皮祖细胞的可能机制为上调VEGF、SDF-1水平,进而促进了骨髓内皮祖细胞向外周血的释放。结论5.1通冠胶囊能够改善PCI术后患者的左室收缩功能和室壁运动指数。可能机制为其可以上调PCI术后患者外周血内皮祖细胞的数量,进而动员EPCs归巢到缺血的心肌处修复损伤血管内皮,建立侧支循环或分化为成熟的心肌细胞。5.2通冠胶囊可以加速损伤血管内膜的再内皮化,抑制大鼠颈动脉球囊损伤后的内膜增生和管腔狭窄,对PCI术后再狭窄有一定的防治作用。5.3通冠胶囊能够动员骨髓内皮祖细胞,参与修复损伤血管内膜,与其能够上调外周血中的VEGF、SDF-1水平有关。