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磷是植物必需的第二大矿质营养元素。土壤无机磷酸盐易被铝、铁或钙固定，导致土壤有效磷含量低。植物在长期低磷胁迫和进化过程中，能够通过根系重建，改变根系形态提高植物磷的吸收效率。油菜是世界上重要的油料作物，需磷较多，对缺磷敏感。低磷胁迫下，植物体内糖的积累与磷信号的转导和根系发生发育密切相关。前期研究表明，海藻糖的前体物质海藻糖-6-磷酸(Trehalose-6-phosphate, T6P)参与调控植物体内蔗糖的利用和组织分配。
本课题采用自制油菜全生育期根箱系统，研究不同磷处理下，甘蓝型油菜全生育期根系发生发育及磷素吸收累积规律。结果发现，延长光照能够增强油菜对低磷胁迫的忍耐，进而增加其生物量和产量，推测糖类物质在低磷胁迫中发挥重要作用；利用生物信息学等方法在甘蓝型油菜基因组数据库查找海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)同源基因，从转录水平筛选与低磷胁迫有关的候选基因；运用转基因技术，构建BnaC2.TPS8遗传转化材料，考察不同磷和氮浓度下，转基因拟南芥和转基因油菜，与野生型比较，生长发育和生理表型差异，揭示候选基因的功能。主要研究结果如下：
(1)不同磷水平处理下，甘蓝型油菜全生育期根系和地上部发生发育的动态变化
以甘蓝型油菜“中双11号”为研究材料，采用自制根箱，研究低磷(每kg土壤施5mgP2O5)和高磷(对照处理，每kg土壤施150mgP2O5)处理下，油菜全生育期根系和地上部发生发育规律。自制根箱玻璃板上观察获取的两个磷处理油菜全生育期根构型指标变化趋势与从土壤中挖根测定的根构型指标变化趋势一致，玻璃板上观察到的根构型可以指示土壤中根系的生长状况。在整个生育期，低磷处理油菜根系和地上部生物量均较低。高磷处理，油菜根系总长度和根尖数目，苗期至盛花期增加，随后从花期至角果期下降，角果至收获期有上升的趋势；低磷处理时，根系总长度和根尖数目在苗期至角果期上升，随后有降低的趋势。全生育期高磷处理根系生长速率大于低磷处理，且生育后期低磷处理根系出现早衰。低磷和高磷处理，根冠比均在盛花期达到最大值。从苗期到抽薹期，低磷处理根冠比远大于高磷处理，抽薹期后两个处理根冠比则相反。高磷处理油菜单株籽粒产量是低磷处理的3倍。
从现蕾期到成熟期，高磷处理根系生理磷利用效率比低磷处理增长更快。从盛花期到成熟期，高磷处理根颈的生理磷利用效率显著大于低磷处理。高磷处理地上部生理磷利用效率从苗期到抽薹期增加，从抽薹期到花期略有下降。角果期的角果和茎杆生理磷利用效率以及成熟期茎杆和种子的生理磷利用效率，均表现出高磷处理显著大于低磷处理。研究还发现，增加日照时长显著提高油菜地上部生物量、籽粒产量，尤其是低磷处理油菜地上部生物量和籽粒产量。
(2)甘蓝型油菜海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)基因家族特征及其在响应低磷胁迫中的功能
利用生物信息学在甘蓝型油菜基因组数据库(“Darmor-bhz”)中共鉴定到51个BnTPS/TPP基因，划分为3个亚家族。甘蓝型油菜BnTPS第二亚家族基因内含子数目较少，低磷胁迫时基因表达量较其他两个亚家族高。BnTPS/TPP保守结构域含TPS(糖基转移酶)和TPP(海藻糖磷酸酶)结构域。利用苗期营养液培养试验和现蕾期土培盆栽试验，研究不同磷水平和光照强度处理BnTPS/TPP基因表达的差异，鉴定到3个同时响应低磷胁迫和外源高光照强度(或外源蔗糖)的基因，分别为BnaC2.TPS8、BnaA9.TPS11和BnaC9.TPS11。
组织化学定位试验结果表明，BnaC2.TPS8在拟南芥中表达部位主要为：幼苗期整个地上部和根系，花期的柱头和成熟的花粉粒。低磷胁迫和外源葡萄糖均会影响BnaC2.TPS8启动子融合GUS蛋白(proBnaC2.TPS8-GUS)的组织定位。低磷胁迫显著增强根系GUS蛋白表达量，添加葡萄糖时减弱根系GUS强度；长期缺磷时，添加葡萄糖时显著减弱主根GUS蛋白表达，同时显著增强侧根GUS蛋白表达。
低磷胁迫时，与野生型比较，拟南芥超表达BnaC2.TPS8转基因株系地上部花青素显著积累，侧根生长受到显著抑制，地上部淀粉降解较慢，对外源NAA(α-萘乙酸)敏感性减弱。营养液培养，超表达BnaC2.TPS8转基因株系，与野生型比较，地上部生物量降低。苗期营养液培养时，油菜BnaC2.TPS8的CRISPR-Cas9转基因株系，与野生型比较，地上部生长受到显著抑制，低磷胁迫时生长受到的抑制减轻。
(3)超表达BnaC2.TPS8拟南芥对低氮胁迫和外源糖表现更敏感
拟南芥原生质体转化试验表明，BnaC2.TPS8蛋白定位于细胞质基质。短期低氮胁迫时(6 h)，甘蓝型油菜“中双11号”地上部和根系BnaC2.TPS8的表达量显著上升，随着低氮胁迫时间延长，BnaC2.TPS8基因表达量逐渐降低。拟南芥超表达BnaC2.TPS8转基因株系，与野生型比较，侧根对低氮和外源糖的响应更加敏感，地上部花青素积累更多。体内双分子荧光互补(BiFC)试验表明：AtTPS8/BnaC2.TPS8蛋白与AtAKIN10、AtTPS1、AtTPS9、AtTPS10和AtMPK4蛋白存在相互作用。
本课题采用自制油菜全生育期根箱系统，研究不同磷处理下，甘蓝型油菜全生育期根系发生发育及磷素吸收累积规律。结果发现，延长光照能够增强油菜对低磷胁迫的忍耐，进而增加其生物量和产量，推测糖类物质在低磷胁迫中发挥重要作用；利用生物信息学等方法在甘蓝型油菜基因组数据库查找海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)同源基因，从转录水平筛选与低磷胁迫有关的候选基因；运用转基因技术，构建BnaC2.TPS8遗传转化材料，考察不同磷和氮浓度下，转基因拟南芥和转基因油菜，与野生型比较，生长发育和生理表型差异，揭示候选基因的功能。主要研究结果如下：
(1)不同磷水平处理下，甘蓝型油菜全生育期根系和地上部发生发育的动态变化
以甘蓝型油菜“中双11号”为研究材料，采用自制根箱，研究低磷(每kg土壤施5mgP2O5)和高磷(对照处理，每kg土壤施150mgP2O5)处理下，油菜全生育期根系和地上部发生发育规律。自制根箱玻璃板上观察获取的两个磷处理油菜全生育期根构型指标变化趋势与从土壤中挖根测定的根构型指标变化趋势一致，玻璃板上观察到的根构型可以指示土壤中根系的生长状况。在整个生育期，低磷处理油菜根系和地上部生物量均较低。高磷处理，油菜根系总长度和根尖数目，苗期至盛花期增加，随后从花期至角果期下降，角果至收获期有上升的趋势；低磷处理时，根系总长度和根尖数目在苗期至角果期上升，随后有降低的趋势。全生育期高磷处理根系生长速率大于低磷处理，且生育后期低磷处理根系出现早衰。低磷和高磷处理，根冠比均在盛花期达到最大值。从苗期到抽薹期，低磷处理根冠比远大于高磷处理，抽薹期后两个处理根冠比则相反。高磷处理油菜单株籽粒产量是低磷处理的3倍。
从现蕾期到成熟期，高磷处理根系生理磷利用效率比低磷处理增长更快。从盛花期到成熟期，高磷处理根颈的生理磷利用效率显著大于低磷处理。高磷处理地上部生理磷利用效率从苗期到抽薹期增加，从抽薹期到花期略有下降。角果期的角果和茎杆生理磷利用效率以及成熟期茎杆和种子的生理磷利用效率，均表现出高磷处理显著大于低磷处理。研究还发现，增加日照时长显著提高油菜地上部生物量、籽粒产量，尤其是低磷处理油菜地上部生物量和籽粒产量。
(2)甘蓝型油菜海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)基因家族特征及其在响应低磷胁迫中的功能
利用生物信息学在甘蓝型油菜基因组数据库(“Darmor-bhz”)中共鉴定到51个BnTPS/TPP基因，划分为3个亚家族。甘蓝型油菜BnTPS第二亚家族基因内含子数目较少，低磷胁迫时基因表达量较其他两个亚家族高。BnTPS/TPP保守结构域含TPS(糖基转移酶)和TPP(海藻糖磷酸酶)结构域。利用苗期营养液培养试验和现蕾期土培盆栽试验，研究不同磷水平和光照强度处理BnTPS/TPP基因表达的差异，鉴定到3个同时响应低磷胁迫和外源高光照强度(或外源蔗糖)的基因，分别为BnaC2.TPS8、BnaA9.TPS11和BnaC9.TPS11。
组织化学定位试验结果表明，BnaC2.TPS8在拟南芥中表达部位主要为：幼苗期整个地上部和根系，花期的柱头和成熟的花粉粒。低磷胁迫和外源葡萄糖均会影响BnaC2.TPS8启动子融合GUS蛋白(proBnaC2.TPS8-GUS)的组织定位。低磷胁迫显著增强根系GUS蛋白表达量，添加葡萄糖时减弱根系GUS强度；长期缺磷时，添加葡萄糖时显著减弱主根GUS蛋白表达，同时显著增强侧根GUS蛋白表达。
低磷胁迫时，与野生型比较，拟南芥超表达BnaC2.TPS8转基因株系地上部花青素显著积累，侧根生长受到显著抑制，地上部淀粉降解较慢，对外源NAA(α-萘乙酸)敏感性减弱。营养液培养，超表达BnaC2.TPS8转基因株系，与野生型比较，地上部生物量降低。苗期营养液培养时，油菜BnaC2.TPS8的CRISPR-Cas9转基因株系，与野生型比较，地上部生长受到显著抑制，低磷胁迫时生长受到的抑制减轻。
(3)超表达BnaC2.TPS8拟南芥对低氮胁迫和外源糖表现更敏感
拟南芥原生质体转化试验表明，BnaC2.TPS8蛋白定位于细胞质基质。短期低氮胁迫时(6 h)，甘蓝型油菜“中双11号”地上部和根系BnaC2.TPS8的表达量显著上升，随着低氮胁迫时间延长，BnaC2.TPS8基因表达量逐渐降低。拟南芥超表达BnaC2.TPS8转基因株系，与野生型比较，侧根对低氮和外源糖的响应更加敏感，地上部花青素积累更多。体内双分子荧光互补(BiFC)试验表明：AtTPS8/BnaC2.TPS8蛋白与AtAKIN10、AtTPS1、AtTPS9、AtTPS10和AtMPK4蛋白存在相互作用。