马尾松（Pinus massoniana）速生、耐干旱瘠薄、适应性强,是我国南方贫瘠地区造林的先锋树种。由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）引起的松树萎蔫病是一种松树毁灭性病害,该病害严重威胁马尾松的健康生长。目前,在马尾松应对松材线虫入侵的抗病机制研究方面,发现部分与抗病性相关基因。本实验室前期研究获得了马尾松响应松材线虫侵染的多个抗病基因,其中DRG（disease resistant gene）基因在马尾松感病过程中被抑制表达,推测该基因可能与马尾松的抗病性有关。为深入研究该基因与寄主抗松材线虫病的相关性,本研究克隆了马尾松DRG基因的CDS,并通过构建DRG基因融合GFP的重组表达载体遗传转化模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）,进一步研究转基因拟南芥对松材线虫侵染的防御能力,探索DRG基因的抗性调控作用。主要结果如下:克隆了马尾松DRG基因的CDS,经测序与同源性比对,结果显示DRG基因CDS长度624 bp,编码207个氨基酸;与报道的欧洲赤松（Pinus sylvestris）的Avr9/Cf-9 rapidly elicited gene（Ps ACRE）的CDS长度一致,核苷酸组成存在3个碱基差异;编码的氨基酸仅1个差异,表明两者的同源性高,在不同松树品种间较为保守,因而认为该基因是马尾松的ACRE基因（PmACRE）。通过构建PmACRE基因融合GFP的重组表达载体遗传转化拟南芥,进一步通过PCR检测、荧光显微观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达以及Western-blotting检测ACRE融合蛋白的表达,获得阳性转PmACRE基因拟南芥。对拟南芥进行人工接种松材线虫,通过镜检和表型观察,结果显示线虫能在伤口处定殖并迁移到叶片中,引起叶片变黄和枯萎,表明松材线虫成功侵染了拟南芥。通过比较接种不同虫量下转基因拟南芥及转空载体对照组的发病情况,结果显示,松材线虫对转PmACRE基因拟南芥的致病力低于其对转空载体对照组的致病力,不同侵染虫量对转PmACRE基因拟南芥的致病率为28%～46%,而对转空载体对照组的致病率为37%～59%。由此可见,PmACRE基因能够提高拟南芥对松材线虫侵染的防御能力。深入研究发现,接种1 d、2d、3 d、5 d时,转基因拟南芥叶片中抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性,总酚和总黄酮植保素类次生化合物的含量均高于对照组。进一步利用GFP-Trap的免疫共沉淀（Co-IP）技术捕获ACRE的互作蛋白,研究ACRE蛋白在拟南芥中的调控网络。质谱鉴定和蛋白功能分析结果显示,ACRE蛋白与ATP合酶α、β亚基、丝氨酸羟甲基转移酶、过氧化氢结构域蛋白、黑芥子硫苷酸酶、二氢硫辛酸脱氢酶、酮醇酸还原异构酶、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸还原酶、S-腺苷甲硫氨酸合酶、谷氨酰胺合成酶等多个蛋白相互作用。对互作蛋白进行GO数据注释分析,结果显示ACRE的互作蛋白在GO中参与最多的细胞组分是胞质、质体、包膜、非膜性细胞器和质外体,参与最多的分子功能是结合功能和催化活性,参与最多的生物过程是细胞过程、对无机物的反应和金属离子的响应;KEGG富集分析发现,富集最多的是代谢途径通路,其次是次生代谢物的生物合成以及碳代谢通路。而丝氨酸羟甲基转移酶、S-腺苷甲硫氨酸合酶、过氧化氢酶、谷氨酰胺合成酶、ATP合酶α、β亚基、脂肪氧合酶等在抗逆和代谢调控过程中起重要作用。综上所述,本研究结果表明PmACRE基因能够调控拟南芥抗松材线虫侵染,提高了拟南芥中APX的活性,增强了黄酮类、酚类化合物合成,提高了拟南芥的抗病防御能力;ACRE蛋白通过与次生代谢通路、解毒抗逆通路、初级代谢通路中的多个蛋白相互作用,调控拟南芥中植保素类次生代谢物的合成,增强毒性物质的清除,提高拟南芥的抗病性。研究结果为挖掘有效调控马尾松抗松材线虫病能力的功能基因提供理论依据,并为揭示松材线虫与寄主复杂的互作机制提供参考。