帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)的主要病理改变是中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性减少,引起黑质纹状体系统多巴胺水平降低。服用左旋多巴制剂的多巴胺替代治疗至今仍是最为有效的治疗方法,但其远期疗效欠佳,症状波动,异动症以及精神症状长期困扰着患者和医疗人员。细胞移植是目前帕金森病治疗的新方法之一,如何在体外获得足量的多巴胺能神经元一直是神经科学界面临的一个难题。胎脑移植有比较好的效果,但是由于伦理束缚和来源限制,不能够得到广泛应用。骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)是骨髓内的一种多潜能干细胞,在一定条件下,可分化为神经细胞。它可以直接从个体骨髓中获得,来源充足,取材方便,创伤小,且避免了移植技术难以逾越的移植排斥问题和伦理学的束缚,因此BMSCs定向诱导分化成为神经元甚至是多巴胺能神经元成为帕金森病研究领域的热点。骨髓基质细胞向神经样细胞分化的机制还不确定。研究者认为内在基因机制和种系限制以及细胞的命运是可塑的,环境可以引起细胞多潜能作用的发挥。神经组织或细胞微环境可以增强BMSCs向神经细胞方向分化的能力。纹状体是黑质多巴胺能神经元主要投射部位,是黑质多巴胺能神经元发挥生理作用的关键环节。动物实验已证实将BMSCs移植到纹状体,能够改善帕金森病大鼠或小鼠的行为。其可能作用机制是:BMSCs具有分泌神经营养因子的功能;BMSCs注入纹状体后,在局部微环境的作用下分化为神经细胞,如胶质细胞、多巴胺能神经元等。又有体外实验表明纹状体提取液对多巴胺能神经元有促进存活的作用,对细胞的分化有促进作用,还可以促进细胞突触生成。在进化的过程中,哺乳动物继承了多方面的机制以保护自己应对外来侵犯。帕金森病患者脑内DA能神经元70-80%丢失仍能保持正常运动,提示着一种自我保护机制。我们设想,帕金森大鼠纹状体提取液可以促进BMSCs向神经细胞方向分化,甚至分化为多巴胺能神经元。我们进一步设想正常纹状体(正常侧)提取液和PD纹状体(损伤侧)提取液两者间具有诱导作用上的差异。因此,我们进行了帕金森大鼠纹状体提取液诱导BMSCs的尝试,以期利用纹状体的生理作用以及纹状体提取液对细胞的促分化作用和对多巴胺能神经元的保护作用,诱导BMSCs分化成为神经细胞甚至是多巴胺能神经元。同时比较正常纹状体提取液与PD纹状体提取液作用上的可能差异性。本实验研究的目的:利用细胞培养技术,为BMSCs纹状体移植治疗帕金森病的机制提供直接依据。具体实验步骤:1,幼年大鼠骨髓基质细胞体外培养扩增与生物性状观察;2,帕金森大鼠纹状体提取液对骨髓基质细胞的诱导作用。第一部分幼年大鼠骨髓基质细胞体外培养与观察目的:体外分离培养大鼠骨髓基质细胞,通过超微结构观察和免疫组织化学检测探讨细胞生物学特性。方法:收集幼年大鼠骨髓细胞,利用贴壁培养法纯化扩增。培养细胞至第三代,相差显微镜及HE染色,扫描电镜和透射电镜观察细胞生长状态和细胞形态;免疫细胞化学染色检测细胞表面神经标记物巢蛋白(Nestin),神经特异性烯醇化酶(neuron special enolase,NSE),胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)。结果:电镜下细胞表面见大量微绒毛结构,一些细胞有单个或多个突起样结构。多数细胞膜完整,胞浆内存在丰富的细胞器;胞核大而明显,染色质分布正常;细胞间连接较少,可见缝隙连接。免疫细胞化学检测胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)阳性细胞15.05±3.92%。结论:贴壁培养法是体外培养大鼠BMSCs的稳定可靠的方法体系。第三代大鼠BMSCs具有生长旺盛,增值能力强,分化程度低的特点;部分细胞可表达GFAP。第二部分帕金森大鼠纹状体提取液对骨髓基质细胞的诱导作用目的:探讨帕金森大鼠纹状体提取液在体外诱导骨髓基质细胞分化为神经细胞的可能。方法:建立单侧(右侧)帕金森病大鼠模型,取出双侧纹状体分别制成正常纹状体(正常侧)提取液与PD纹状体(损伤侧)提取液,制成不同浓度含纹状体液的无血清培养基(诱导液)。收集幼年大鼠骨髓细胞,利用贴壁培养法纯化扩增获取三代细胞进行实验。MTT法分别检测不同浓度纹状体诱导液对BMSCs生长状态的影响。取10%,60%,90%诱导液(共六组)培养BMSC,相差显微镜下观察细胞生长状态和细胞形态变化。于48小时后收集诱导后的细胞,免疫细胞化学染色检测细胞表面神经标记物巢蛋白(Nestin),神经特异性烯醇化酶(neuron special enolase,NSE),胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH),计数阳性率。结果:相差显微镜下,部分细胞脱落,不再贴壁生长,悬浮于培养液中。仍然贴壁的细胞失去原有圆形或梭形外观,为不规则的多边形或长棒状。有的细胞团簇样存在,向四周伸出辐射状或长或短的较粗的刺状突起,还有的细胞单个存在,胞体不规则,向周围伸出单个或多个细长的突起样结构。免疫细胞化学染色显示,诱导后正常纹状体诱导液10%浓度组NSE阳性率为3.25±2.37%,GFAP阳性率为48.44±29.47%;60%浓度组NSE阳性率为20±8.62%,GFAP阳性率为54.60±33.14%;两组间无统计学差异。PD纹状体诱导液10%浓度组Nestin阳性率为12.23±5.57%,GFAP阳性率为55.56±30.23%;60%浓度组Nestin阳性率为11.92±4.01%,GFAP阳性率为55.56±30.23%;两组间亦没有统计学差异。各诱导组TH表达均为阴性。结论:帕金森大鼠纹状体提取液可以引起BMSCs形态学改变。与第三代BMSCs相比,诱导后GFAP阳性细胞显著增多,同时出现NSE,Nestin阳性细胞。总论1.贴壁培养法是体外培养大鼠BMSCs的稳定可靠的方法体系。第三代幼年大鼠BMSCs具有生长旺盛,增值能力强,分化程度低的特点;部分细胞表达GFAP。2.帕金森大鼠纹状体提取液可以引起第三代BMSCs发生形态学改变,部分细胞具有长短不一的突起样结构。与第三代BMSCs相比,诱导后GFAP阳性细胞显著增多,同时出现NSE,Nestin阳性细胞,但是没有TH阳性细胞。