中药茯苓[Poria cocos(Schw.)Wolf]为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核,具有利水渗湿、健脾、宁心等功效。作为药食同源中药材,茯苓在药品、食品、保健品中均有广泛应用。茯苓中主要的活性成分为茯苓多糖,具有较强的免疫活性,但是茯苓多糖难以被吸收,如何发挥免疫活性还有待探索。本研究对茯苓中主要的活性成分茯苓多糖进行提取纯化,建立茯苓多糖提取纯化的工艺,并对纯化后的茯苓多糖进行结构表征和组成成分解析,再通过脾虚模型,探索茯苓多糖的对脾虚大鼠的免疫调节与肠道菌群之间的关系,旨在为茯苓多糖对脾虚大鼠的免疫调节的机制提供新的可能。目的:通过采用超声提取技术结和大孔树脂纯化技术提取纯化茯苓多糖,并采用劳倦过度法和饮食不节法两种复合造模方法复制脾虚模型,探索茯苓多糖的对脾虚大鼠的免疫调节作用与肠道菌群之间的关系,旨在为茯苓多糖对脾虚大鼠的免疫调节的机制提供新的可能。方法:(1)以茯苓多糖提取率为指标,采用正交实验方法优选超声提取茯苓多糖最佳工艺。(2)以蛋白去除率、色素去除率以及多糖保留率为综合指标,采用正交实验优选大孔树脂纯化茯苓多糖的最佳工艺,并采用红外光谱(IR)和气相色谱(GC)对纯化的多糖的结构及组成成分进行表征。(3)采用劳倦过度法和饮食不节法两种复合造模方法造脾虚模型,给予茯苓多糖低(75 mg/kg)、中(150 mg/kg)高(300 mg/kg)剂量干预21 d,从大鼠一般状态、病理指标(H&E)、生理指标(体重、体温)、小肠推进率、粪便含水量等综合指标评价脾虚大鼠模型;采用血细胞分析仪检测外周白细胞数目,用Elisa试剂盒方法检测大鼠血清Ig G、Ig M、IL-10、TNF-a,IL-6的含量以及小肠内容物Slg A的含量,用免疫组化的方法检测脾和胸腺组织的CD3~+T细胞和CD19~+B细胞的数量以及小肠组织中Ig A和ZO-1蛋白的表达,考察茯苓多谈多脾虚大鼠免疫功能的影响。(4)采用劳倦过度法和饮食不节法两种复合造模方法造脾虚模型,采集大鼠结肠粪便,采用16S r RNA基因测序技术,对样本相关细菌的DNA进行提取与检测,检测合格后用金唯智设计的一系列PCR引物扩增原核生物16S r RNA基因上包括V3和V4的2个高度可变区,再进行Meta Vx TM文库构建、Ilumina Mi Seq测序、序列比对和物种鉴定分析。进而分析肠道菌群的相对丰度、多样性及分布变化。结果:(1)茯苓中茯苓多糖最佳提取工艺为茯苓粉末过80目筛,料液比1∶20,超声温度为室温,超声功率为240 w,超声时间为5 min,茯苓多糖提取率为3.4%。(2)茯苓多糖最佳纯化工艺为AB-8型大孔吸附树脂,溶液p H为5,摇床转速为180 r/min,振荡2 h,该茯苓多糖主要由阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)和葡萄糖(Glc)组成,保留时间分别为8.552、11.813、11.973和12.100min,摩尔比为0.091:0.116:0.154:0.298。(3)造模21 d模型组大鼠明显出现毛发枯黄稀疏,倦怠懒动,眯眼的生理状态;模型大鼠体重增长缓慢,体温无明显变化;在消化道上,模型大鼠消化道推进速度增快,出现大便稀溏;在病理变化上,模型大鼠胸腺组织出现明显病理的改变,脾脏组织为未出现明显病理改变。给予茯苓多糖干预后,可在一定程度上改善这一情况;在免疫指标的检测上,结果表明,给予茯苓多糖干预后,大鼠的白细胞以及淋巴细胞的含量明显上升,差异具有统计学意义。低剂量茯苓多糖对白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞以及单核细胞的影响较小,不具有统计学意义,低中高茯苓多糖剂量组均可不同程度提高Ig G、Ig M和IL-10的表达,显著降低IL-6和TNF-a的表达。茯苓多糖可增加脾虚鼠脾和胸腺组织CD3~+T细胞和CD19~+B细胞的数量,增强脾虚大鼠小肠液s Ig A和小肠组织Ig A和ZO-1蛋白的表达。(4)对大鼠结肠粪便进行16Sr RNA测序分析,在不同分类水平下(门、纲、目、科、属、种),空白对照组的肠道菌群物种数都是最高的,与对照组相比,脾虚模型组的肠道菌群的丰度均显著下降且处于失调状态。在门、纲、目三水平上,茯苓多糖对失调状态下脾虚大鼠的肠道菌群的调节作用并不明显。在科水平上,与模型组相比,茯苓多糖低中高剂量组均可以显著提高肠道菌群的丰度。在属、种水平上,茯苓多糖中高剂量组可以显著提高肠道菌群的丰度。值得注意的是,在门水平上,脾虚模型组肠道菌群稳态被破坏,具体表现在厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度比值(F/B)明显增大,给予茯苓多糖干预后,F/B逐渐恢复,且表现剂量依耐性;在属水平上,脾虚模型组出现大量的乳酸菌属(Lactobacillus),而普雷沃氏菌属(Prevotella)、内拟杆菌属(Muribaculaceae)、普雷沃氏菌属＿UCG-003(Prevotella＿UCG-003)的丰度明显降低。在给予茯苓多糖干预后,脾虚大鼠肠道菌群的丰度及其结构逐渐恢复到对照组水平,但普雷沃氏菌属＿UCG-003的丰度仍然低于对照组;在种水平上,脾虚模型组中乳酸杆菌的丰度大量增加,成为丰度最大的优势菌种,普雷沃氏菌属＿UCG-003,拟普雷沃菌属(Alloprevotella),粪杆菌真核菌群([Eubact-erium]＿coprostanoli-genes＿group),毛螺菌属NK4A136组菌群(Lachnospiraceae＿NK4A136＿group)的丰度均下降。给予茯苓多糖干预后,乳酸杆菌的丰度逐渐恢复到正常水平,且呈剂量依耐性。结论:脾虚大鼠免疫功能低下且肠道菌群处于失调状态,茯苓多糖可以增强脾虚大鼠的免疫功能和恢复肠道菌群的稳态,提示我们,茯苓多糖可能通过调节肠道菌群发挥增强免疫的作用。