论文部分内容阅读
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，EC 1.15.1.1，简称SOD）是一种金属酶类，它可分为四类，分别是Cu／Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD。SOD是一种重要的氧自由基清除剂，能催化超氧阴离子（O2-）的歧化反应。SOD与多种人类疾病有关，是一种具有较大潜力的药物酶。 目前，SOD大多是从天然动植物中提取，为解决来源的限制的问题，美、日、英、德等国相继开发了人SOD基因工程产品，并进行了临床试验。我国科研人员也在人源Cu／Zn-SOD、Mn-SOD的基因工程方面做了大量工作。近年来，随着国内外对Fe-SOD研究的逐渐深入，Fe-SOD的基因工程研究有着深远的意义。 本文采用PCR技术，以念珠藻基因组为模板，克隆获得了Fe-SOD基因，构建pUCm-S质粒并进行了测序分析，发现其拥有所有的Fe-SOD保守序列，与念珠藻Nostoc commue stain DH1基因只有90％同源性，证明该藻种可能与后者来源于不同的亚种。高级结构预测表明，该基因翻译的蛋白质含有两个结构域，与Fe-SODA的结构极其相似。我们再以pUCm-S质粒为模板进行PCR，并将这段含酶切位点的Fe-SOD基因重组到原核表达载体pET22b（+）中，与pe1B信号肽进行融合表达。IPTG诱导表达表明，Fe-SOD融合蛋白实现了高水平表达，在最佳表达条件37℃、1mM IPTG浓度、诱导表达5小时后，其外源基因表达量占全菌蛋白的78％，刷新了原核表达SOD高产的新记录。亚细胞定位实验表明，产物主要以包涵体的形式出现，并不存在于周质空间中。二次洗涤包涵体，可以获得纯度较高的目的蛋白，这为工业化生产提供了条件。由于融合蛋白带有6×His标签，使用Ni2+亲和层析纯化，可以获得超高纯度的目的蛋白，亲和层析结果表明，当咪唑浓度达到60 mmol／L左右时，开始有目的蛋白洗出，直至咪唑浓度到达100 mmol／L时结束。纯化后的目的蛋白经含有精氨酸的变性溶液稀释复性后，连苯三酚方法检测表明，该复性蛋白具有SOD活性。这是我国首次利用基因工程方法获得Fe-SOD。