半个多世纪以来,围绕着经络实质问题,现代多学科在经络物质基础、经穴的生物学效应、针灸机制等领域开展了广泛研究,揭示了大量与经络有关的生物学效应,提出了多种学说,而近几年来,筋膜结缔组织与腧穴相关的研究日益成为这一领域的研究热点。原林教授以往采用数字人解剖学技术,能够在人体内构建出与传统“经络—穴位”有很强对应性的一类影像结构,我们称之为“筋膜结缔组织支架”,并通过CT、MRI、超声等医学放射影像学手段,重建出人体结缔组织连线,其中部分连线与中医古籍的经络走行非常接近。结合发育生物学观点,因此认为人体可分为由非特异性结缔组织构成的筋膜结缔组织支架组成人体支持与储备系统和已经分化的功能细胞所组成的功能系统两大系统。支持与储备系统中的未分化干细胞不断为功能系统提供源源不断的细胞源并分化各种成定向干细胞、进而分化成功能细胞,且前者在神经和免疫系统的参与下,调节细胞的功能状态和生命状态,为功能系统细胞的生存提供一个稳定的内部环境。以两个系统观察和研究人体结构的解剖学研究方法我们称为筋膜解剖学而针刺对于机体的作用多是通过对于穴位的刺激来调节人体的功能状态,且“得气”主要在于结缔组织对针体的缠绕。所以,本研究拟通过免疫组织化学和免疫印迹方法等技术手段观察针刺后穴位区和非穴位区筋膜结缔组织中MAPK信号通路蛋白的变化,以进一步从微观角度为“筋膜与经络”相关的理论提供佐证,并进一步解释筋膜结缔组织支架对人体生理病理状态的调节作用。研究目的1、通过观察针刺前后筋膜的形态学改变,探讨针刺作为一种机械应力,在细胞内转导进而引起生物学反应的最为基础的反应—组织学形变是如何发生的。并且探讨针刺作为一种伤害性刺激,对于脊髓的形态学有无影响。2、通过免疫组织化学染色,观察针刺前后ERK1/2和P38MAPK在针刺局部浅筋膜组织和脊髓的表达及其在细胞内的定位和移位情况,从针刺局部和脊髓两个解剖学层面和信号转导角度探讨针刺影响机体的机理。3.通过比较穴位和非穴区筋膜ERK的表达情况,从筋膜结缔组织角度探讨穴位的特异性;通过观察针刺后不同时间点ERK信号蛋白表达的差片,探讨针刺后对于筋膜的最佳取材时间点,为进一步的研究打下基础。4.通过Western-Blot免疫印记技术,半定量观察各组大鼠ERK1/2和P38MAPK在针刺局部浅筋膜组织和肌肉组织的表达强弱,探讨针刺对局部的筋膜、肌肉的影响差异,以及针刺对穴位和非穴区信号蛋白影响的差异,为“筋膜与经络”相关理论提供进一步的佐证。材料与方法1、针刺对局部筋膜结缔组织和脊髓形态学的影响。25只SD大鼠随机分为5组,每组5只。空白对照组小施加任何处理,手针非穴位组在大鼠右侧腹股沟中点处针刺,隔日1次。手针后三里组大鼠针刺入后三里穴后,行针方法如手针非穴位组。电针后三里组大鼠针刺得气后,连6805AⅡ型电针仪,频率2HZ。治疗10次后取材。各针刺组大鼠分别取以针刺点为圆心,直径约1.5cm的区域的浅筋膜约200mg,空白对照组在非穴针刺点的相应位置取材。经4%多聚甲醛固定,经冲洗、脱水、透明等处理后,分别制作2张石蜡切片用于HE染色。然后各组大鼠经4%多聚甲醛灌注,“微型椎板咬骨钳”取出脊髓组织后制作2张石蜡切片用于HE染色。利用Olympus图像分析系统分析HE染色图像。拉伸刺激组大鼠于腰1-2水平脊柱旁开2cm处局部备皮,消毒,以针尾为参照物顺时针捻转5周,捻转末用血管夹夹持针柄与皮肤,5min/次,隔日一次,共刺激10d,于末次刺激次日取材,取材后制作铺片。荧光双染后利用相差显微镜获取铺片图像。2、免疫组织化学方法观察ERK1/2和P38在筋膜和脊髓中的表达。实验动物如上(资料与方法1),选取空白对照组、手针后三里组、电针后三里组,手针非穴位组等4组动物,处理方法如上,浅筋膜及脊髓取材后,分别制作2张防脱石蜡切片,利用S-P法进行免疫组化染色。利用Olympus图像采集系统采取图像,并用Imagepro-plus6.0进行图像分析,以平均光密度值(MD,MeanDensity)作为比较指标,SPSS13.0软件包对统计结果进行分析。3、Western—Blot检测在ERK1/2在浅筋膜中的含量和与表达与针刺后时间关系。18只SD大鼠,随机分为6组,其中对照组3只,针刺1、2、3、4、5组各3只。针刺各组在大鼠腹股沟区给予电针治疗后,分别在针刺后0h、1h、6h、12h和36h等5个时间点取以针刺点为圆心,直径约1.5cm处的浅筋膜,对照组也在针刺点相应的部位和后三里穴区取材。取材后利用凯基全蛋白提取试剂盒、凯基BCA蛋白含量检测试剂盒分别对组织进行提取和定量,Western-blot检测各组的ERK1/2及p-ERK1/2的表达情况,利用ECL发光试剂盒显色,Kodak Image Station 2000 MM成像系统采集图像,采用图像处理软件Image Tool 3.0测定并分析条带灰度值以检测ERK的表达水平,利用SPSS13.0统计软件包比较各个针刺时间点以及非穴和后三里穴区的ERK表达情况,统计方法分别采用One-Way ANOVA方差分析和两独立样本t检验。4、Western—Blot观察ERK1/2和P38在筋膜和脊髓中的表达含量。材料:凯基全蛋白提取试剂盒、凯基BCA蛋白含量检测试剂盒兔多抗ERK1/2、鼠单抗p-ERK一抗、兔多抗P38、β-actin、PVDF膜以及免疫印迹化学发光试剂盒均购自美国Santa Cruz公司。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG和辣根酶标记山羊抗鼠的抗体;SABC(兔抗IgG)-AP试剂盒和SABC(小鼠IgG)-AP试剂盒购自武汉博士德生物公司,组织匀浆器(德国FLUKO公司,超细匀浆器),BIO-RAD半干转膜仪购自Bio-Rad公司。实验动物与分组同材料与方法1。空白对照组、手针后三里组、电针后三里组,手针非穴位组等4组动物处理后,取针刺点局部筋膜和肌肉,经蛋白提取和定量后,用Western-blot检测各组的ERK1/2、p-ERK1/2及P38的表达情况,利用SPSS软件包对所得数据进行统计分析,统计方法采用One-Way ANOVA方差分析对各组间ERK1/2、p-ERK1/2和P38的表达情况进行分析。结果1、针刺后浅筋膜中纤维排列较对照组更为规则;组织细胞核形态发生改变,由原来的圆形或椭圆形变为扁梭形或长条状,而电针后浅筋膜中纤维排列顺序和细胞核形态改变并不典型,荧光双染发现牵拉引起胞外基质变形、纤维紧张并与拉力方向平行排列,细胞骨架重构成“扁梭形”、胞浆纵轴长而致密、细胞突起界限不清,胞核小、呈长梭形,对照组大量细胞杂乱无序填充在纤维网格内、单位面积内细胞密度较小、细胞分界清晰,胞内骨架伸展成“片状”、多突起并相互形成联系,胞核近似圆形位于胞浆中心。针刺前后脊髓未见明显形态学改变。2、光镜下观察,大鼠脊髓背角ERK1/2免疫组化反应显色呈棕黄色,阳性细胞分布于脊髓灰质神经元集中的部位,针刺后深染部位向胞核集中。在浅筋膜中,ERK1/2和P38阳性染色区域多集中在成纤维细胞或巨噬细胞核周围,P38染色较ERK1/2淡,空白对照组染色较弱,其他各组针刺后有一定程度增加,但以手针非穴位组增加明显。对各组MD进行统计分析显示,处理各组治疗后浅筋膜的ERK1/2和P38与对照组相比均有一定增加(P＜0.05),均以手针非穴位组增加显著。但脊髓的ERK1/2和P38变化情况与筋膜并不完全一致,手针后三里组和手针非穴位组ERK1/2在大鼠脊髓中的表达针刺后有减弱趋势。3、非穴与后三里穴浅筋膜层的ERK和磷酸化ERK的表达情况均未见明显差异(均P＞0.0)。针刺后各组针刺侧的ERK1/2的表达均显著高于自身对照侧(均P＞0.05)。针刺后0h、1h、6h、12h ERK1的表达水平逐渐增高,12h达最高,36h在逐渐回落,但针刺后各个时间点ERK2以及针刺对照侧的ERK1/2表达并不完全按这个趋势,约在针刺后6h达到高峰。4、各组针刺后ERK1/2、P-ERK1/2和P38的表达都有明显提高,且各组间蛋白表达均有显著性差异(P＜0.05)。One-way ANOVA分析显示,与对照组相比,ERK1/2、p—ERK1/2与P38在筋膜和肌肉中的表达以针刺非穴组增加最为显著(均P＜0.05),其次是电针后三里组和针刺后三里组。结论1、牵拉引起筋膜结缔组织胞外基质变形、纤维紧张并与拉力方向平行排列,针刺使胞核由原来的圆形或椭圆形变为扁梭形或长条状,而电针后浅筋膜中纤维排列顺序和细胞核形态改变并不典型,提示针刺作为一种机械应力主要通过捻转、提插等手法使局部的结缔组织缠绕针体进而发生组织学形变的。基于体外培养的细胞的证据,这些形态学改变很大程度上伴随着重要的细胞信号的修复,基因表达和基质黏附,所以,这些组织学变化为帮助我们进一步理解各种各样的机械疗法(物理治疗,推拿和针灸等)的治疗机理提供了一把钥匙。2、免疫组化结果说明:针刺无论是对于非穴和穴位局部筋膜中的ERK1/2和P38表达均有上调作用,且以手针非穴位组增加明显,这可能因为非穴针刺点皮下筋膜结缔组织非常丰富,针刺入皮下捻转,能够带动较大范围的结缔组织,产生很强的沉紧感,而后三里穴区皮下筋膜相对较少,捻转针体只能带动较少的结缔组织。阳性染色区域在脊髓中的移位,说明针刺对这种信号蛋白的活化作用。但ERK1/2和P38在脊髓中的表达与在筋膜中并不完全一致,从一个侧面证实针灸对人体的影响除了神经.体液等调节以外,筋膜结缔组织支架的存在可能构成另外一个较为原始的调控网络。3、在正常的疏松结缔组织中,ERK细胞信号转导蛋白一直有非磷酸化和磷酸化的表达,而这种表达又与细胞的增值和分化有关。这表明从发育生物学角度由中胚层发育来的非常古老的疏松结缔组织结构,在生命个体的新陈代谢中,一直发挥着活跃的、积极的作用。而从细胞信号转导的角度,穴区的浅筋膜与非穴区尚未发现有明显的差别。4、免疫印迹结果利用信号蛋白半定量的手段进一步证实了无论是针刺入穴位和非穴均能上调局部筋膜的ERK1/2和P38的表达。也证实针刺点局部肌肉无论是针刺前后均有一定的ERK1/2、磷酸化ERK1/2和P38的表达,且针刺后也有升高,其改变程度与筋膜呈正相关。综上所述,本研究分别采用了HE染色、免疫组化、免疫印迹等技术手段,从针刺作用于机体的始动环节——针体对浅筋膜的牵拉和对肌肉的刺激着手,区别于以往的“穴位刺激——靶器官反应”的对于针灸研究的传统模式,且从观察ERK1/2和P38两种信号蛋白变化的角度,来探讨针刺作用于机体在生物学层面的普遍的机制,这是从筋膜角度研究针刺机理的一个新的尝试。本研究发现穴位与非穴筋膜中的信号蛋白表达无差异,进一步说明广泛分布的结缔组织中穴位与非穴位只有“量”的不同而没有“质”的区别。本研究观察到针刺首先造成了筋膜的组织学形变,对于筋膜和脊髓中信号蛋白的表达影响不完全相同,以往研究发现皮下组织的成纤维细胞建立了一个广泛的细胞之间互相连接的网络,各个细胞之间通过直接连接进行信息的交流,可以设想,筋膜结缔组织对于免疫、血管和神经细胞等组织和器官的影响,不可能象神经系统通过反射弧这样高级,且从发育生物学角度,结缔组织又是非常古老的一类组织,而MAPK细胞信号转导又几乎存在于所有的真核细胞中,是生物进化中较原始的一种细胞信息间的交流方式。所以,针刺可能就是通过首先影响筋膜结缔组织支架,使组织细胞发生形变,进而影响MAPKs等细胞信号通路蛋白的表达,进而导致体内的生物化学等反应,达到调节机体的效应的。