丁草胺和三唑磷是国内近年大量使用的两种农药，并且对人类和生态环境表现出潜在的毒害，但其检测方法目前主要局限于理化方法，免疫化学分析方法研究甚少，因此，本文对丁草胺和三唑磷的的酶免疫化学进行了研究。 一、半抗原、人工抗原合成 在碱性条件下将巯基丙酸与丁草胺连接，经过薄层色谱，核磁共振、质谱、红外光谱鉴定，表明丁草胺半抗原BMPA合成成功。采用混合酸酐法和活泼酯法将BMPA与载体蛋白BSA或OVA连接，合成出4种人工抗原，紫外光谱鉴定表明丁草胺人工抗原合成成功。 三唑磷半抗原合成采用无水乙醇和三氯硫磷反应合成出中间产物Ⅰ，比较了4种方法合成中间产物Ⅱ，4种方法都在一定程度上合成出中间产物Ⅱ。其中，以乙腈法产率较高。以6-氨基己酸为手臂合成了三唑磷半抗原A，经薄层层析、质谱及1H-NMR鉴定，表明合成成功。通过HPLC-MS对半抗原A合成过程中的副产物进行了分析，推测副产物主要是连接两个苯唑醇的磷酸酯和烷氧基磷酸酯基氨基酸，在三唑磷半抗原合成过程中，以甲醇作溶剂会发生甲氧基和乙氧基的置换反应。以3-巯丙酸为原料，与中间产物Ⅱ反应制备半抗原B，质谱鉴定表明半抗原B合成成功。以己酸内酯为原料，水解制得6-羟基己酸，然后与中间产物Ⅱ反应制备半抗原C，质谱鉴定表明半抗原C合成成功。 二、抗体制备 用活泼酯法合成的丁草胺免疫抗原BMPA-A-BSA免疫动物后有特异性多克隆抗体产生。对BMPA-A-BSA免疫所得血清检测时，用BMPA-M-OVA作包被抗原的检测灵敏度优于用BMPA-A-OVA作包被抗原。用两种包被抗原分别建立了ciELISA，其中B-A-ciELISA检测限为0.47μg/mL，IC50=1.82μg/mL；B-M-ciELISA检测限为0.038μg/mL，IC50=1.08μg/mL。 采用活泼酯法将三唑磷半抗原A与载体蛋白BSA和OVA偶联，制备出人工免疫原和包被抗原，免疫小鼠，制备出三唑磷抗体；阻断试验发现检测时加入适量有机溶剂有助于检测效果改善；采用37℃1h然后4℃过夜的包被方式检测效果优于单纯4℃过夜的包被方式。 三、cdELISA方法的建立 丁草胺抗体采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶，发现氧化30min，碳酸盐缓冲液中透析3h，所得酶标抗体克分子比为1.55，酶标抗体活性较好。对TMB显色条件优化研究发现，pH3.3的磷酸-柠檬酸缓冲液显色效果优于pH5.0、5.6、6.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，且与商品试剂盒的显色液显色效果相当。用磷酸柠檬酸缓冲液时，DMF作溶剂溶解TMB后显色效果优于甲醇、乙醇、DMSO作溶剂；TMB的浓度0.15mg/mL时显色效果较好。 研究了BMPA-M-OVA包被浓度、酶标抗体浓度、反应时间、保护剂BSA、TW-20、pH、离子强度、多种有机溶剂、样品基质效应等对丁草胺cdELISA的影响，结果表明稀释液采用2×PBS的离子强度，反应1h，反应介质不含BSA，TW-20浓度0.01％，pH7.4，检测方法的IC50为5.48ng/mL，检测限为0.0015ng/mL，检测范围0.034～3449.94ng/mL，批内变系数9.25％，批间变异系数23.55％，方法性能明显优于常规的间接竞争ELISA方法。有机溶剂对丁草胺ELISA反应影响很大，稀释液中含有适量异丙醇和丙酮，可提高反应的灵敏度，但含甲醇、DMF、乙腈时，灵敏度都会下降。用所建立的cdELISA对实际水样中的丁草胺检测，发现有较严重的基质效应，矿泉水和自来水尤甚。各种水样经过10倍稀释，在1～10ng/mL时矿泉水、自来水、珠江水、池塘水、稻田水、蒸馏水在的平均回收率分别为158.50％、157.10％、73.25％、119.75％、124.51％、93.27％。 本论文首次研究标记抗体方式的丁草胺直接竞争ELISA，较系统的研究了多种理化因素对标记抗体直接竞争ELISA性能的影响，建立了一种尚未见文献报道的标记抗体包被抗原式的直接竞争ELISA检测丁草胺的方法，研究结果对于农药酶免疫分析商品试剂盒开发具有一定的理论参考意义。同时合成了3种三唑磷半抗原，制备出三唑磷抗体，并对半抗原合成中可能的副产物利用HPLC-MS进行了分析，研究结果对于有机磷类农药的半抗原合成及其免疫分析具有较强的借鉴意义。