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由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）感染引起的结核病（Tuberculosis,TB）是一种严重威胁全球公共卫生的慢性消耗性传染病。在过去的几十年中,多重耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）结核病的出现使结核病的防治越来越具有挑战性。当前传统抗结核药物已经不能满足临床需要,新型抗结核药物的研发成为当务之急,筛选有效的抗结核药物靶标是开发新型抗结核药物的主要瓶颈。MTB发病机制涉及错综复杂的病原体-宿主相互作用,MTB感染后多种效应蛋白靶向宿主细胞,从而调控宿主免疫应答。结核分枝杆菌免疫逃逸、潜伏感染相关病原因子、宿主因子是潜在的抗结核药物靶点。MTB进入宿主细胞后释放的DNA能与cGAS结合,随后激活cGAS-STING通路,调控I型干扰素应答。另外,结核分枝杆菌c-di-AMP能以一种不依赖cGAS的方式介导STING通路的激活。目前,关于MTB调控宿主cGAS-STING通路的具体机制仍然知之甚少,MTB靶向cGAS-STING通路的基因作为结核药物靶点的潜力还有待探究。本文通过GST-pull down和质谱分析筛选MTB中与STING互作的效应蛋白,在筛选得到的10个候选蛋白中,进一步验证确定Rv3248c蛋白参与调控Ⅰ型干扰素应答。随后对Rv3248c的生物学功能进行鉴定,探讨了 Rv3248c蛋白对于宿主cGAS-STING信号通路依赖的调控功能,为新型抗结核药物靶点的挖掘提供新思路。1.结核分枝杆菌H37Ra靶向宿主STING信号分子互作效应蛋白的筛选本研究首先通过使用UniProt等蛋白结构预测网站对cCAS-STING通路中的STING信号分子进行功能域分析并对STING蛋白进行构建和表达。随后使用GST-pull down筛选结核分枝杆菌H37Ra菌株中与STING互作的效应蛋白并进行质谱分析,获得10个候选互作效应蛋白。经文献检索及功能分析选择部分蛋白进行过表达重组耻垢分枝杆菌的构建,结果显示成功构建6株重组耻垢分枝杆菌。为了探究筛选获得的效应蛋白是否参与调控宿主Ⅰ型干扰素应答,使用构建的重组菌分别感染含IRF3-Luc报告基因的J774-DualTM细胞系,测定细胞上清的荧光素酶活性水平,结果显示与对照菌相比,重组菌rMS::pMV261-Rv3248c感染组细胞上清的荧光素酶活性显著降低,表明Rv3248c基因可能参与抑制宿主Ⅰ型干扰素信号通路活化;随后进行重组菌rMS::pMV261-Rv3248c的生物学特性测定,菌落形态观察结果显示,与对照菌相比,Rv3248c过表达重组菌的菌落表面褶皱减少、更为光滑;重组菌生物膜形成测定结果显示Rv3248c过表达重组菌生物被膜的形成低于对照菌,表明Rv3248c抑制分枝杆菌生物膜的形成;通过H2O2和SDS胁迫试验,结果显示Rv3248c过表达重组菌的抗逆性和生存能力降低。2.结核分枝杆菌Rv3248c调控宿主STING分子介导的Ⅰ型干扰素应答随后以Rv3248c蛋白为研究对象,成功构建Rv3248c真核表达质粒和原核重组蛋白等材料,深入探究Rv3248c对于宿主Ⅰ型干扰素应答的调控功能。首先使用重组菌感染RAW264.7细胞后进行qRT-PCR和ELISA测定,结果显示Rv3248c显著下调细胞IFN-[β的转录和分泌表达水平;同时,通过Western blot实验对RAW264.7细胞感染后cGAS-STING通路以及其下游JAK-STAT通路活化水平进行测定,结果显示Rv3248c重组菌感染组巨噬细胞STING分子的磷酸化水平和TBK1分子表达水平显著下调,表明Rv3248c参与抑制宿主细胞cGAS-STING信号通路活化;为了进一步证实Rv3248c对Ⅰ型干扰素信号通路活化的影响,将Rv3248c真核表达质粒、IRSE报告质粒,分别和STING、TBK1、IRF3真核表达质粒共转染,进行细胞上清荧光素酶活性测定,结果显示Rv3248c可以显著抑制TBK1诱导的Ⅰ型干扰素通路活化水平;为了探究Rv3248c是否直接调控宿主Ⅰ型干扰素应答,使用Rv3248c重组蛋白刺激RAW264.7细胞,随后通过Western blot实验对RAW264.7细胞cGAS-STING通路信号分子活化水平进行测定,结果显示Rv3248c重组蛋白可以抑制2’,3’-cGAMP诱导的巨噬细胞STING分子的磷酸化水平,并下调LPS诱导的TBK1分子的表达水平。为了探究Rv3248c对于分枝杆菌胞内存活的影响,使用重组菌rMS::pMV261-Rv3248c感染RAW264.7细胞并进行胞内分枝杆菌计数,结果显示Rv3248c下调分枝杆菌的胞内存活水平;为了进一步在体内探究Rv3248c对于宿主Ⅰ型干扰素应答的调控功能,将重组菌rMS::pMV261-Rv3248c以腹腔注射方式感染小鼠,使用qRT-PCR对小鼠组织中细胞因子的转录水平进行检测,结果显示Rv3248c重组菌感染组小鼠肺脏和脾脏中IFN-β、IL-6、IL-1β转录水平显著下调;进一步对Rv3248c重组菌在小鼠体内的定殖能力进行测定,结果显示Rv3248c的过表达抑制分枝杆菌在体内的存活:另外对小鼠组织病理切片进行分析,结果显示Rv3248c减少小鼠肝脏中粒细胞浸润并减轻耻垢分枝杆菌感染诱导的肝细胞坏死。综上所述,MTBRv3248c通过下调STING分子磷酸化和TBK1分子表达,从而抑制Ⅰ型干扰素信号通路活化;通过体内和体外实验揭示了 Rv3248c显著下调Ⅰ型干扰素及炎性应答相关基因转录水平,降低分枝杆菌的胞内存活水平和小鼠体内载量,以上结果表明Rv3248c具有作为抗结核药物靶点和结核疫苗靶标的潜力。