鸡KLF15基因的组织表达特性及多态性分析研究

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KLFs (Kruppel-like factor)是具有Cys2/His2锌指DNA-蛋白结构,属于锌指转录因子亚家族,参与多个细胞生理过程的调节,如细胞增殖、细胞分化等过程。KLF15作为KLF家族的重要成员同样具有重要的生物学功能,前人研究表明,KLF15基因在骨骼肌的生长和脂肪代谢等方面具有重要的调控作用。本研究主要进行了鸡KLF15基因的组织表达规律研究,及其遗传变异与固始鸡x安卡鸡F2代资源群经济性状的关联分析,并通过双荧光素酶报告系统对单核苷酸多态性(SNP)的功能进行了验证。本试验利用荧光定量PCR技术对鸡KLF15基因在固始鸡不同时期不同组织中的表达规律进行了探索。利用混合DNA池测序技术对该基因全序列进行了SNPs扫描,共发现20个突变位点,其中18个位于内含子,2个位于外显子。经过对所有SNPs进行功能预测后,着重对内含子2上的一个2-bp插入/缺失突变(G1378113782del/insAG)进行了研究,通过PCR-RFLP技术对固始鸡x安卡鸡F2代资源群个体进行分型,并与资源群生长性状、屠体性状、肌纤维性状和血液生化指标等表型性状进行了关联分析。利用淅川乌骨鸡纯系对该SNP位点进行了群体验证,并通过荧光定量PCR技术分析了该SNP不同基因型的表达规律,最后利用双荧光素酶报告系统进一步分析了该位点不同基因型是否能够对荧光素酶活性产生影响。主要结果如下:1.选择19种物种的KLF15基因的氨基酸序列进行同源比对,发现19种物种共被分为两大类:斑马鱼和其他。在第二大类中,12种鸟类分为一类。在鸟类中,鸡与原鸽和虎皮鹦鹉在一个层级,说明鸡与二者进化关系较近。从遗传距离来看,鸡与斑马鱼的亲缘关系最远,与虎皮鹦鹉的亲缘关系最近。2.对固始鸡1日龄和36周龄的胸肌、大脑、小脑、肾脏、腿肌、心脏、肺脏、脾脏、腺胃和肝脏等10种正常器官组织进行了表达规律研究分析。相对定量的研究结果表明,在1日龄时,鸡KLF15基因在肝脏中的相对表达量最高,在胸肌中的相对表达量最低;在36周龄时,在腺胃中相对表达量最高,在胸肌中最低。3.对于G1378113782del/insAG位点,计算其在F0、F1和F2代中等位基因频率,结果表明在三个世代中insAG的频率均高于delAG。通过混合线性模型计算该位点不同基因型与F2代资源群的表型性状的关联性,关联分析结果表明该缺失突变与F2代资源群中体重、屠体重和胫长等生长性状显著相关(P<0.05)。除初生重和0周龄胫长为delAG/delAG型大于insAG/insAG外,其余关联性状均为insAG/insAG型具有最高值。该位点与肌纤维性状和血液生化指标等并不具有关联性。4.在淅川乌骨鸡纯系中,G1378113782del/insAG不同基因型与体重、胫长、胫围等生长性状关联分析的结果表明,该位点与骨盆宽显著关联(P<0.05),与其他性状则并没有表现出显著关联性。对于体重、胫长、龙骨长、骨盆宽等性状,insAG/insAG基因型的值高于delAG/delAG。5.通过对不同基因型在F2代资源群鸡肝脏中的表达规律分析,发现insAG/insAG型的相对表达量最高,insAG/delAG次之,delAG/delAG最低。构建pGL3-Pro-del AG和pGL3-Pro-ins AG表达载体,利用双荧光素酶报告系统对该缺失功能进行了进一步验证。结果表明,对于DF1细胞,pGL3-Pro-delAG和pGL3-Pro-insAG荧光表达值均低于pGL-Pro载体,pGL3-Pro的表达值显著高于pGL3-Pro-insAG,pGL3-Pro-delAG和pGL3-Pro-insAG二者表达量并无显著差异;对于Hela细胞,pGL3-Pro-delAG与pGL3-Pro荧光表达量并无显著差异,但pGL3-Pro-insAG的荧光表达值则显著高于pGL3-Pro-delAG与pGL3-Pro,为三者之中最高。由以上试验结果,可得出如下结论:1.鸡KLF15基因在鸡各组织中广泛表达,不同时期呈现出不同的表达模式,但均在胸肌中表达最低。其内含子2上的2-bp插入/缺失突变(G1378113782del/insAG)与鸡的体重、胫长等生长性状的关联分析结果表明,该位点可能与控制生长性状的数量性状位点(QTL)或主效基因连锁,可以考虑作为生长性状选择的分子标记,且insAG/insAG为影响长速的基因型。2.不同基因型表达规律分析结果表明不同基因型表达量存在差异,双荧光素酶报告系统分析结果表明两种含有不同等位基因的表达载体在功能上存在一定差异,说明insAG与delAG两种等位基因在功能上可能存在一定差异,但仍需进一步验证。
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