目的:新生儿肺动脉高压（pulmonary hypertension of the newborn,PHN）是新生儿常见的肺血管性疾病,临床表现为难治性低氧血症、右心室压力进行性增高和右心衰竭,严重者甚至死亡。目前该病仍无特效的靶向防治方案,因此,对其病理机制的研究十分迫切。肺动脉高压的病理改变主要包括肺血管过度收缩、异常血管重构和肺小动脉阻塞即新生内膜形成,其中表达平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）细胞数量的增加是进入不可逆性血管重构,加速肺动脉高压进展的主要原因。除了中膜血管平滑肌细胞增殖和外膜成纤维细胞分化,内膜血管内皮细胞向间充质样细胞表型转化即End MT也是α-SMA样细胞的重要来源。因此,针对End MT调控机制的研究将成为未来靶向治疗肺动脉高压的突破点。miRNAs可参与多种细胞功能,是End MT的重要调控因素,结合课题组前期工作及文献检索发现,miR-29在远端肺小动脉平滑肌细胞和内皮细胞大量表达;miR-29基因敲除鼠肺组织病理改变中可见肺远端小动脉血管璧平滑肌细胞成熟障碍,出现不成熟的合成型平滑肌细胞,由此推测miR-29可能参与异常的肺血管重构。因此本研究筛选miR-29家族作为目的miRNA,验证其在低氧PHN大鼠肺及人肺动脉内皮细胞系中的差异性表达及其与End MT的相关性。Wnt信号传导通路在肺发育及肺部疾病发生中发挥了重要作用。本课题组前期研究发现,Wnt信号通路是高氧诱导BPD新生小鼠肺泡发育障碍的重要调控机制;信号通路中关键蛋白如Wnt3a,Wnt5a,β-catenin在血管部位表达,且预实验证实肺动脉高压大鼠肺组织远端肺血管内壁β-catenin表达增强,提示经典Wnt信号通路同样可能参与肺动脉高压的肺血管重构。为了研究肺动脉高压中miRNAs和信号通路的交互作用在End MT调控中的重要性,我们通过Targetscan网站预测miR-29与经典Wnt信号通路重要调控因子的结合情况,发现miR-29的3’UTR端与Wnt通路中LRP6蛋白存在结合位点。LRP6是Wnt信号通路中重要的Wnt配体共激活受体,作为一种细胞跨膜表面蛋白,可与Wnt配体、Frizzled蛋白结合,介导典型Wnt/β-catenin信号通路的激活。LRP6与肺部疾病相关性研究数据尚少,且多集中在调节肺部肿瘤细胞的增殖、迁移及转分化,慢性肺损伤方面仅在少量BPD相关研究中报道,因此,LRP6在肺动脉高压中内皮细胞功能障碍和血管重构的作用仍需进一步探讨。本研究通过观察LRP6,Wnt/β-catenin体内外的动态变化情况,试图证实上述信号通路的激活是促进肺血管重构,新生儿肺动脉高压形成的重要调控机制。通过干预miR-29,LRP6的水平及双荧光素报告基因等实验方法,试图证实miR-29在低氧PHN中通过靶向抑制LRP6,影响Wnt/β-catenin信号通路,进一步实现对End MT的调控。研究方法:1、使用10%低氧处理新生SD大鼠建立低氧PHN模型,分别于实验第0、7、14、21天PHN和对照组随机选取10只大鼠,分离肺组织后行HE染色观察肺组织形态学;qRT-PCR方法检测miR-29a,miR-29b及miR-29c在肺组织的动态变化;qRT-PCR联合Western-blot方法检测End MT相关指标Snail,CD31,α-SMA及信号传导通路中LRP6,β-catenin基因mRNA和蛋白水平在肺组织的动态变化;21天两组大鼠分别行右室压力测定反映肺动脉压力,计算右心室肥厚指数,免疫荧光染色明确肺远端小动脉血管内壁CD31和α-SMA定位,观察远端肺小血管End MT发生情况。2、以hPAECs为研究对象,1%低氧处理72小时建立肺血管内皮细胞的低氧损伤细胞模型,收集24、48、72小时细胞,在细胞水平研究miR-29a,miR-29b及miR-29c的动态变化;使用qRT-PCR联合Western-blot方法检测Snail,CD31,α-SMA,LRP6及β-catenin指标mRNA和蛋白水平在体外细胞模型中的动态变化;免疫荧光染色对上述指标差异性表达进行进一步验证,观察β-catenin核转移及CD31、α-SMA共定位的发生情况。3、依据PHN动物及细胞模型的差异表达情况,选取模型中下调最为显著的miR-29a和表达明显增加的LRP6作为研究目标,细胞模型上分别过表达miR-29和抑制LRP6,通过qRT-PCR和Western-blot方法检测干预后NC、NC+hypoxia和miR-29a-3p mimic+hypoxia/si LRP6+hypoxia不同细胞组别间End MT相关指标,如Snail、CD31和α-SMA的变化情况。4、使用miR-29a mimics和miR-29a inhibitor转染hPAECs建立miR-29a过表达和抑制细胞模型,通过qRT-PCR和Western-blot方法检测干预miR-29a后LRP6水平的变化;利用双荧光素酶报告基因验证miR-29a-3p与LRP6的结合;使用miR-29a-3p mimic转染hPAECs,将细胞分为NC、NC+hypoxia、miR-29a-3p mimic+hypoxia三组,转染48-72小时后观察LRP6、Wnt/β-catenin信号通路及End MT相关基因Snail、CD31、α-SMA的水平变化情况。结果:1、Western-blot和qRT-PCR检测模型动物肺组织和模型组细胞中CD31表达显著下降,α-SMA和Snail表达显著增高,免疫荧光双染PHN中远端肺小动脉血管内壁及模型组细胞可见CD31、α-SMA共表达。2、qRT-PCR证实模型动物肺组织和模型细胞中miR-29a,miR-29b及miR-29c表达下降,其中以miR-29a改变最为显著;上述miR-29家族的下降与CD31,α-SMA及Snail水平的变化存在时间相关性,即伴随着miR-29水平的下调,CD31表达降低,Snail及α-SMA表达增高。3、Western-blot和qRT-PCR方法检测PHN组大鼠肺组织及肺血管内皮细胞低氧损伤细胞模型组中LRP6,β-catenin基因的mRNA和蛋白水平显著增高;免疫荧光染色验证上述指标模型组中表达量上调,细胞模型中低氧组还可见β-catenin核表达的增加。4、成功构建miR-29a过表达细胞模型,发现NC+hypoxia与NC组比较,CD31下调而α-SMA及Snail上调;miR-29a-3p mimic+hypoxia与NC+hypoxia组比较,上述指标变化得以部分逆转,CD31水平回升,Snail和α-SMA表达量降低。构建LRP6下调细胞模型,Western-blot方法结果发现Snail、CD3和α-SMA变化趋势同miR-29a过表达组。5、成功构建miR-29a过表达和miR-29a抑制细胞模型,发现miR-29a过表达组与NC组比较,LRP6的水平显著下降,而miR-29a抑制组与NC组比较,LRP6的水平明显增高。双荧光素酶报告基因检测结果显示,共转染LRP6-mut+miR-29a-3p mimics组与LRP6-wt+miR-29a-3p mimics组比较,荧光酶活性明显增高,提示LRP6可与miR-29a-3p直接结合。6、构建miR-29a过表达细胞模型,观察NC+hypoxia与NC组比较,LRP6及β-catenin表达增加,同时CD31下调而α-SMA及Snail水平增高;miR-29a-3p mimic+hypoxia与NC+hypoxia组比较,LRP6表达量显著降低,同时β-catenin,Snail及α-SMA表达也明显下降,CD31水平回升。结论:1、低氧PHN动物及细胞模型中均存在End MT的发生,病理过程与miR-29家族,特别是miR-29a表达下调密切相关。miR-29a可通过调控End MT在低氧PHN中发挥潜在保护作用。2、低氧PHN动物及细胞模型中均存在LRP6,Wnt/β-catenin信号通路激活,LRP6参与低氧PHN中End MT的发生。3、miR-29a-3p能够靶向结合LRP6,降低PHN内皮细胞中LRP6活性,使得Wnt/β-catenin信号传导通路激活障碍,抑制End MT的发生,可成为未来PHN防治的新靶点。