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研究背景放疗是骨肉瘤治疗的重要手段之一。放疗抵抗是影响患者疗效和预后的关键因素。前期研究表明，脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶(APE1)具有DNA损伤修复和氧化还原双功能，在骨肉瘤放疗抵抗中发挥核心调节作用，敲低APE1能显著增强骨肉瘤放疗敏感性。然而其介导骨肉瘤放疗敏感性的机制不清。MicroRNAs(miRNAs)能在转录后水平负性调节靶基因的表达，对肿瘤发生、细胞凋亡和应激反应具有重要的调控作用，为研究和发现APE1基因调控通路和相互作用蛋白，阐明APE1介导的骨肉瘤放疗敏感性的机制提供了新的研究方向。此外，miRNAs作为内源性的小分子，在调控肿瘤细胞放疗敏感性中具有明显的优势，为骨肉瘤的分子靶向治疗提供了新的策略。晚近的研究陆续报道了p53等肿瘤关键基因相互作用的miRNAs，但与APE1相互作用的miRNAs国内外鲜见报道。研究目的本研究旨在鉴定和研究APE1相互作用miRNAs及其在骨肉瘤放疗抵抗中的作用。研究方法1.通过生物信息学、miRNAs芯片和qRT-PCR筛选鉴定APE1-knockdown骨肉瘤细胞的miRNAs差异表达谱，分析其靶基因涉及的细胞生物学功能和信号通路。2.通过生物信息学、 EMSA、 RNAi和qRT-PCR实验初步验证APE1-转录因子-miRNAs的作用关系。3.利用生物信息学、双荧光素酶报告基因实验、AP位点切除实验及EMSA鉴定miRNAs对APE1的靶向调控作用，在细胞和动物水平验证miRNAs靶向抑制APE1对骨肉瘤细胞放疗后增殖和凋亡的影响。研究结果1. APE1-knockdown骨肉瘤细胞中有13个miRNAs显著变化，其中miR-451、miR-1290、miR-765、miR-483-5p、miR-513a-5p、miR-129-5p和miR-31上调，miR-29b、miR-197、let-7b、miR-324-5p、let-7i和miR-484下调，其靶基因分别涉及TGF-β、Wnt、MAPK和p53等细胞信号通路，与细胞生存、增殖、粘附和肿瘤发生有关。2.生物信息学分析提示，转录因子与miRNAs启动子区有结合位点； APE1-knockdown后可下调NF-κB的DNA结合活性，而抑制NF-κB可下调let-7b和let-7i的表达。3. miR-513a-5p和miR-765能与APE1mRNA3’UTR区结合抑制APE1蛋白表达；miR-513a-5p可抑制APE1的AP位点剪切活性和NF-κB、p53、AP-1的DNA结合活性；在细胞和动物水平给予X射线照射后，过表达miR-513a-5p可增加凋亡，抑制骨肉瘤细胞增殖和Bcl-2的表达。结论1. APE1能直接影响骨肉瘤细胞miRNAs的表达；生物信息学分析表明APE1通过调控miRNAs可能影响下游靶基因的表达，参与肿瘤发生、细胞生存、增殖、粘附等生物学过程和多个信号通路，与骨肉瘤的发生发展、侵袭转移密切相关。2.生物信息学分析表明APE1-转录因子-miRNAs具有相互作用；初步证实APE1通过调控NF-κB的DNA结合活性可能调控let-7b和let-7i的表达。3.首次证实APE1是miR-513a-5p和miR-765的靶基因，二者可靶向结合APE1mRNA3’UTR区抑制APE1蛋白表达。4. miR-513a-5p通过抑制APE1的DNA损伤修复和氧化还原双功能，抑制骨肉瘤细胞增殖，诱导细胞凋亡，在细胞及动物水平均能增加骨肉瘤的放疗敏感性。