禽白血病病毒(avian leukosis virus, ALV)可以致禽发生多种类型的肿瘤,属于反转录病毒。根据病毒囊膜蛋白的抗原性,分为A-J等10个亚群,其中A, B, C, D, E和J亚群能够感染鸡。J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J, ALV-J)是1980年代由Payne等[1]人从肉鸡中首次分离鉴定。反转录病毒env囊膜蛋白含有两个表面亚单位：一个是SU蛋白(surface unit, SU),另外一个是TM蛋白。SU蛋白含有病毒-受体相互作用的决定簇,能够介导病毒与宿主细胞结合,是决定宿主范围的关键因素,病毒与宿主细胞表面受体的结合是启动病毒感染的第一步,也是最为关键的一步。病毒粒子一旦与受体结合,即会激活病毒与细胞的融合。在反转录病毒中,目前已被鉴定的病毒受体已有很多。例如,猫免疫缺陷病毒(Feline Immunodeficiency Virus, FIV)利用CD4和CD134作为感染宿主细胞的主要受体[’]；人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)利用CD4、CCR5和CXCR4分别作为主要受体和共受体[2]感染人CD4 T细胞；同时,CD4、CCR5和CXCR4亦作为猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus, SIV)的受体参与SIV的感染过程。然而,SIV却广泛地使用各种共受体分子介导病毒感染,例如：CCR1、CCR2b、CCR3、CCR8、GPR1、 GPR15以及其他多种细胞因子受体。这些病毒受体的鉴定为深入研究、了解病毒感染机制和为人类控制疾病发挥了很好的作用。到目前为止,禽白血病病毒受体分离鉴定研究中,已有四种受体蛋白得到鉴定,分别是Tva, Tvb, Tvc和chNHE1。其中,Tva, Tvc和chNHEl分别介导A亚群,C亚群和J亚群禽白血病病毒的感染,而Tvb负责编码B亚群,D亚群和E亚群禽白血病病毒受体。禽白血病病毒曾经作为分析病毒进入宿主细胞的模型用于病毒感染研究,发挥了很好的作用。然而,本世纪初禽白血病尤其是J亚群禽白血病的感染发生很大变化,尤其是在中国出现严重问题,ALV-J从肉用鸡群发展到蛋鸡群,中国的一些地方品种鸡群也可以感染；由单独引起病鸡发生髓细胞瘤、血管瘤发展至可同时引起病鸡的血管瘤、髓细胞瘤,甚至引发病鸡同时产生血管瘤、髓细胞瘤和平滑肌瘤;近几年,相继有报道指出ALV-J在鸡体内与其他免疫抑制病毒(如MDV[13]、REV[14])发生共感染现象。这些现象的发生一方面可能是由于在自然选择压下,env基因可变区的快速变异或基因重组导致病毒毒力和致瘤性的增强以及宿主感染范围的扩大,但更重要的可能是在病毒的感染上存在新的受体。当然,ALV-J gp85基因序列不同程度的变异也可能会导致ALV-J的组织嗜性和细胞受体类型发生变化,继而影响到宿主的范围。为此,本研究利用J亚群禽白血病病毒为模型,通过免疫共沉淀、质谱分析、荧光定量PCR等技术进行了ALV-J新受体的分离鉴定和特性分析。1.ALV-J gp85基因和兔IgGFc基因在腺病毒表达系统中的融合表达首先将本实验室构建的SUJ-rIgGFc基因克隆进pShuttle-CMV载体中,构建腺病毒重组穿梭质粒pShuttle-CMV-SUJ-rIgGFc;重组质粒经线性化后转化BJ5183-AD-1感受态细胞,在感受态细胞内与腺病毒骨架pAdEasy-1同源重组及抗性筛选获得重组腺病毒质粒pAd-SUJ-rIgGFc;重组腺病毒质粒pAd-SUJ-rIgGFc经线性化后转染人293T细胞获得重组腺病毒rAd-SUJ-rIgGFc。通过聚合酶链式反应(PCR)和免疫荧光试验(FA)分析并证明目的基因SUJ-rIgGFc通过腺病毒表达载体在293T细胞中得到很好地表达,且融合蛋白主要分布于293T细胞膜,可被ALV-J特异性单克隆抗体JE9和羊抗兔IgG所识别；Western blot试验结果表明,融合蛋白大小在90-95kd左右,与JE9以及羊抗兔IgG均有很好的反应性。同时,将重组病毒感染MDCK细胞,利用免疫荧光试验分析,表明重组病毒能够感染MDCK细胞,融合蛋白在MDCK细胞中表达良好。本研究利用腺病毒表达系统在人293T细胞成功融合表达了ALV-J gp85基因和兔IgG Fc基因,获得了能够表达目的基因的重组病毒；同时,通过MDCK扩增重组病毒,收获并纯化融合蛋白,为下一步分离ALV-J受体提供了重要的物质基础。2.J亚群禽白血病病毒受体的分离鉴定和质谱分析利用DF1细胞系和pcDNA-env DF1细胞系作为受体供体细胞,为免疫共沉淀试验提供目的蛋白,同时采用两种方案进行免疫共沉淀试验。方案一,将DF1细胞膜蛋白与融合蛋白SUJ-rlgGFc、protein A agarose进行免疫共沉淀试验,沉淀产物经SDS-PAGE和银染后,切胶并进行质谱鉴定。方案二,pcDNA-env DF1细胞经裂解后分离膜蛋白,与抗ALV-Jenv蛋白单克隆抗体JE9、protein A agarose resin进行免疫共沉淀试验,沉淀洗脱蛋白经SDS-PAGE和银染后,切胶,进行质谱分析。SDS-PAGE结果显示,两种方案获得的免疫共沉淀产物中均得到约80kd和38kd的两个蛋白条带。经质谱分析,这两种蛋白分别是78kd葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated Protein, GRP78)和膜联蛋白A2 (annexin,ANXA2)。提示,本研究分离的能够与ALV-J SU蛋白特异结合蛋白是ALV-J疑似受体,为进一步鉴定和验证疑似受体奠定了基础。3.GRP78和ANXA2在J亚群禽白血病病毒感染中的功能分析通过抗GRP78多抗和抗ANXA2多抗在DF1细胞中进行感染抑制试验,以检验GRP78和ANXA2在J亚群禽白血病病毒粒子进入靶细胞或在早期感染过程中是否发挥着受体的功能。首先,利用抗GRP78和抗ANXA2多抗封闭DF1细胞表面GRP78和ANXA2,然后用ALV-J感染DF1细胞,并用甘氨酸处理灭活细胞外的病毒粒子,48小时后通过间接免疫荧光试验、免疫印迹试验、荧光定量PCR分别检测细胞中ALV-J env的表达水平,同时通过测定细胞上清中的ALV-J的TCID50鉴定病毒效价,从而判定抑制病毒感染的效果。试验结果显示,经多抗封闭的DF1细胞中ALV-J env的表达水平均有所下降。病毒滴度测定结果显示,当抗体浓度达到50μg/mL时,抗GRP78多抗和抗ANXA2多抗对病毒感染的抑制率分别可达到93.2%和98.4%；IFA和Western blot结果显示,随着阻断抗体浓度的加大,DF1细胞中ALV-J env蛋白表达越来越少,病毒滴度也显著降低,而作为对照,抗体对ALV-A的感染无抑制作用。结果表明,病毒感染所需的受体被特异性抗体所封闭,启动病毒感染的第一步即病毒与受体的结合被有效阻断,从而导致病毒感染率的下降。本研究中,细胞表面GRP78和ANXA2的缺失是导致ALV-J感染率的急剧下降甚至出现ALV-J的感染失败的根本原因,表明GRP78和ANXA2是ALV-J的受体。4.J亚群禽白血病病毒受体chGRP78和chANXA2重建试验chGRP78和chANXA2作为J亚群禽白血病病毒受体,能够介导ALV-J进入宿主细胞从而启动病毒感染。那么,如果在非易感细胞表面建立同样的受体模型,ALV-J是否还能感染非易感细胞?或者,chGRP78和chANXA2是否还具有介导ALV-J进入非易感细胞的功能?为此,本研究利用人胚肾细胞(HEK293T细胞)和鹅胚成纤维细胞(GEF)作为受体重建靶细胞,以DF1细胞总RNA为模板扩增chGRP78和chANXA2基因全序列,并构建真核表达质粒pcDNA3.1-chGRP78和pcDNA3.1-chANXA2。chGRP78和chANXA2分别或共同转染GEF或293T细胞,转染48小时候后感染ALV-J (M.O.I=5),并于感染后不同时间点收获细胞,通过间接免疫荧光试验或荧光定量PCR方法检测细胞内ALV-J env的表达。ALV-J (M.O.I=5)感染表达chGRP78和/或chANXA2的GEF细胞,病毒吸附2小时候甘氨酸(Ph3.0)灭活未进入细胞的病毒粒子,48小时候收获GEF细胞并裂解,将细胞裂解物接种DF1细胞,培养7天后,利用间接免疫荧光试验(IFA)检测病毒增殖情况。IFA结果显示,共表达chGRP78和chANXA2的GEF细胞以及表达chANXA2的GEF细胞裂解物接种的DF1细胞均能产生可见的特异性荧光,而表达chGRP78或空载体的GEF细胞裂解物接种的DF1细胞未见特异性荧光,说明chANXA2和chGRP78在GEF细胞中的表达有效地介导并协助了病毒粒子进入细胞,完成了病毒感染关键的第一步：而在两个受体之间,chANXA2应该较chGRP78承担着更为主要的作用或角色。同时,表达chGRP78或chANXA2的293T细胞在感染ALV-J后，通过real-time PCR检测感染后12h、24h、48h和72h四个时间点293T细胞内ALV-J env基因的相对表达水平。结果显示,表达chGRP78或chANXA2的293T细胞内ALV-J env基因的相对表达水平相对空载体转染的293T细胞要高得多。在感染后48小时内,表达chGRP78的293T细胞中ALV-J env基因的相对表达水平出现上升,并于48小时达到最高值；表达chANXA2的293T细胞中ALV-J env基因的相对表达水平在72h出现持续上升趋势；而共表达chGRP78和chANXA2的293T细胞中env的相对表达水平亦呈现上升趋势,并在48h达到最高。研究结果表明,chGRP78和chANXA2在293T细胞中获得表达,且ALV-J env的mRNA相对表达水平呈现动态变化的过程,说明ALV-J病毒粒子确实能够借助293T细胞表面表达的chGRP78或chANXA2进入细胞,证明两种蛋白对介导病毒进入细胞确实发挥了重要作用；而比较293T细胞的荧光定量PCR结果可见,与chGRP78相比较,chANXA2在病毒感染中应该发挥着更为主要的作用。