软骨肉瘤是以产生软骨基质为特征的起源于软骨组织的恶性肿瘤,发病率在恶性骨肿瘤中仅次于骨肉瘤。软骨肉瘤对放化疗均不敏感,手术治疗是目前唯一有效的治疗手段。大多数的软骨肉瘤生长缓慢,较少转移,广泛切除的手术治疗往往可以取得满意的效果。然而对于转移复发、手术不能彻底切除的软骨肉瘤,目前没有有效的治疗方案,预后极差。因此迫切需要新的治疗手段和模式来提高这些患者的生存率和治疗效果。自从上世纪80年代起,免疫治疗作为继手术、化疗、放疗之后第四大治疗模式获得越来越多的重视,被视为治疗恶性肿瘤的一道曙光。我们在之前的研究中发现,Vγ9Vδ2T细胞联合唑来膦酸在体内体外都可以有效杀伤骨肉瘤细胞,并详细研究了可能涉及的途径和机制。因而我们考虑将Vγ9Vδ2T细胞作为软骨肉瘤免疫治疗的效应细胞,探索软骨肉瘤免疫治疗的新路径。本次研究主要分三部分：一、我们检测分析了外周血单个核细胞在ZOL和IL-2刺激下,Vγ9Vδ2T细胞扩增表型的变化。我们发现,体外扩增的Vγ9V62T细胞经历了“量”和“质”的改变。在体外扩增的前期,Vγ9Vδ2T细胞的杀伤作用随着数量和比例的升高而逐渐增强,并在12天至18天达到峰值。此时的Vγ9Vδ2T细胞杀伤活性最强而细胞数量十分充足,细胞表型为效应细胞表型,适合作为杀伤肿瘤的效应细胞。二、我们研究了Vγ9Vδ2T细胞杀伤软骨肉瘤细胞原代细胞及细胞系的能力,结果发现Vγ9Vδ2T细胞对软骨肉瘤具有不同纯度的杀伤能力,然而联合唑来膦酸后,杀伤能力均可大幅度提高。三、建立软骨肉瘤的皮下移植瘤和原位肿瘤裸鼠模型,探索Vγ9Vδ2T细胞在体内动物模型中的治疗作用。结果发现对于皮下已经成瘤的裸鼠,Vγ9Vδ2T细胞联合ZOL没有明显的抑制增殖能力,然而对于皮下尚未成瘤的裸鼠,两者联合治疗可以显著抑制软骨肉瘤增殖。更为重要的是,Vγ9Vδ2T细胞能分布并聚集在肿瘤部位,显著抑制原位软骨肉瘤的生长。我们的研究结果表明,Vγ9Vδ2T细胞联合ZOL具有抑制软骨肉瘤的作用,为软骨肉瘤的免疫治疗提供了实验基础。第一部分Vγ9Vδ2T细胞的体外扩增、纯化及表型鉴定目的:利用外周血单个核细胞扩增Vγ9Vδ2T细胞,分析不同时间点的表型及纯度,利用免疫磁珠纯化细胞。方法：将健康志愿者外周血单个核细胞使用Zol+IL-2刺激并体外扩增,流式细胞技术检测Vγ9V82T细胞表型及纯度,用LDH法检测Vγ9Vδ2T细胞的细胞毒活性。结果：健康志愿者的外周血单个核细胞经过体外培养,Vγ9Vδ2T细胞纯度、杀伤活性逐渐增加,细胞表型由幼稚型向效应性转变。体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞经历了“量”和“质”的改变。12天到18天左右的Vγ9Vδ2T细胞杀伤活性最强而细胞数量十分充足,适合作为杀伤肿瘤的效应细胞。结论：体外扩增Vγ9Vδ2T细胞经历了“量”和“质”的改变,表型和杀伤能力检测均表明12天到18天左右的细胞杀伤活性最佳,适合作为杀伤肿瘤的效应细胞。第二部分Vγ9Vδ2T细胞联合唑来膦酸对软骨肉瘤细胞的体外杀伤作用目的：探讨Vγ9Vδ2T细胞联合唑来膦酸在体外杀伤软骨肉瘤原代细胞以及细胞系的能力方法：应用LDH法检测Vγ9Vδ2T细胞在体外联合唑来膦酸杀伤软骨肉瘤原代细胞以及细胞系的活性；流式细胞术检测共培养后Vγ9Vδ2T细胞CD107a和胞内细胞因子IFN-γ水平。检测软骨肉瘤细胞表面分子的表达水平。应用不同阻断剂分别阻断Vγ9Vδ2T细胞以观察其杀伤软骨肉瘤细胞的机制。结果：1. Vγ9Vδ2T细胞在体外对软骨肉瘤细胞系和原代细胞具有一定的杀伤活性,联合唑来膦酸可显著增强Vγ9Vδ2T细胞的杀伤作用。2.软骨肉瘤细胞可刺激Vγ9Vδ2T细胞分泌IFN-γ.3. Vγ9Vδ2T细胞识别、杀伤ZOL预处理软骨肉瘤细胞主要通过TCR途径和穿孔素-颗粒酶途径。结论：Vγ9Vδ2T细胞联合唑来膦酸在体外具有抗软骨肉瘤作用。第三部分Vγ9Vδ2T细胞的体内抑瘤实验研究目的：研究Vγ9Vδ2T细胞联合唑来膦酸的体内抑瘤活性。方法：分别通过裸鼠皮下、骨髓腔内注射软骨肉瘤细胞,建立软骨肉瘤皮下移植瘤和原位动物模型。动物分为对照组、单独Zol组、单独Vγ9Vδ2T细胞组和Zol+Vy9Vδ2T细胞联合治疗组,尾静脉注射途径接受治疗,观察肿瘤体积变化,动物生存时间。结果：对于已经成瘤的裸鼠,Vγ9Vδ2T细胞联合ZOL和各对照组比较没有明显的抑制作用；然而对于尚未成瘤的裸鼠,两者联合治疗可以显著抑制软骨肉瘤生长,延长成瘤时间和裸鼠的生存时间。Vγ9Vδ2T细胞可以到达肿瘤部位,并对原位软骨肉瘤有明显抑制作用。结论：Vγ9Vδ2T细胞联合唑来膦酸在体内对软骨肉瘤的增殖有抑制作用。