论文部分内容阅读
目的：研究TLRs的激活介导wnt/β-catenin信号通路活化，促进结肠癌细胞的增殖；同时探讨TLRs在结肠癌发生发展中的重要作用及其可能的机制。 方法：为了阐明TLRs活化对肿瘤的影响，通过体外培养结肠癌细胞系HT-29，检测TLRs及wnt/β-catenin表达情况，通过过表达TLRs及siRNA等手段研究TLRs与wnt/β-catenin信号通路的相互关系，探讨TLRs对wnt/β-catenin信号通路激活、促进结肠癌的生长及浸润。1) LPS刺激结肠癌细胞系HT-29，随后用RT-PCR检测TLRs与Wnt/β-catenin信号通路相关基因mRNA的表达水平；2)LPS与顺铂联合处理HT-29细胞，通过MTT方法检测细胞增殖情况，继而确定LPS及DDP的最适作用浓度及时间，建立TLRs活化对细胞耐受的药物模型；3)按照药物模型建立方法，给予细胞药物处理后48h，RT-PCR及Western Blot检测药物模型中各组细胞wnt/β-catenin信号通路相关基因：wnt、β-catenin、P-GSK-3β表达变化，Toll样受体及其相关炎性因子IL-6/TNF-α改变；4) NF-κB荧光素酶报告基因转染细胞后，按照药物模型建立方法，给予细胞药物处理，最后检测模型中各组NF-κB的活化情况；5）siRNA抑制TLR4的信号通路后，Western Blot检测wnt/β-catenin信号通路相关基因的改变。 结果： 1)RT-PCR结果显示LPS刺激HT-29细胞后TLRs（TLR1-10）表达发生了不同程度改变，其中TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8、TLR9等TLRs表达出现不同程度的升高，且 TLR2、TLR4mRNA水平表达上调最为明显；而Wnt/β-catenin信号通路相关基因表达表现为： GSK-3β下调，WNT及β-catenin上调; 2)MTT结果：不同浓度的LPS刺激HT-29细胞，对细胞产生不同程度的抑制或者增殖作用，而当同时给予不同浓度DDP处理后，发现0.5μg/ml浓度的LPS，能有效的抵抗5μg/ml DDP对HT-29细胞的杀伤作用。根据上述结果建立0.5μg/mlLPS处理组、5μg/mlDDP处理组、阴性对照组、LPS联合DDP处理组的药物模型； 3）RT-PCR及Western Blot结果：药物模型组中，与阴性对照组比较，LPS处理组p-GSK-3β表达下调，β-catenin表达上调，DDP组可抑制细胞增殖，同时p-GSK-3β表达上调，β-catenin表达下调，wnt/β-catenin信号通路被抑制；而联合用药组，wnt/β-catenin信号通路相关基因表达改变程度低于DDP组；同时，DDP组TLR2、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9、IL-6和TNF-α表达明显下降，反映TLRs的活化受到抑制，而联合用药组TLRs表达下调程度明显小于DDP组； 4） NF-κB荧光素酶报告基因结果显示：LPS组相对荧光值明显高于其它处理组，而DDP组相对荧光值水平最低，联合用药组高于DDP组，提示LPS能通过激活NF-κB信号从而抑制顺铂引起的细胞凋亡4)siRNA抑制TLR4的信号通路后， P-GSK-3β表达升高，而β-catenin表达出现下调。 结论：本实验结果表明LPS能够通过活化TLRs信号通路从而介导wnt/β-catenin通路的活化，从而干预顺铂引起的HT-29细胞凋亡；这些结果提示TLR4/NF-κB信号通路的活化，IL-6和TNF-a等炎性因子释放，能够介导wnt/β-catenin通路的活化从而促进结肠癌的发生发展。