葡萄生单轴霉孢子囊致病力恢复及保存方法研究

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葡萄生单轴霉是一种专性寄生菌,只危害葡萄,不能在人工培养基上培养和保存。孢子囊是其重要的接种体,孢子囊的致病力、保存以及活力检测方法对病菌的研究至关重要。本文通过筛选对葡萄生单轴霉孢子囊萌发无明显抑制作用的药剂,并利用药剂处理、恒温干燥和真空冷冻干燥的方法处理致病力弱化的菌株,测定其对菌株致病力的影响;尝试利用组培的方式繁殖葡萄组培苗来保存和繁殖病菌;在保存时采用对真空冷冻干燥的保存材料进行真空封存和直接分装,分装后分别在不同温度条件下保存,不同时间取出叶片点接测定发病率;利用MTT染色法和点接生物测定法对不同温度干燥处理后的孢子囊存活力和致病力进行了检测,并应用单因素试验和正交试验对其孢子囊进行了MTT染色条件的优化。本研究主要研究结果如下:  氨苄青霉素、多菌灵浓度在50.0μg·mL-1对孢子囊萌发无明显抑制作用,两种药剂混合处理后孢子囊叶片点接发病率最高,发病率为65.3%,单用氨苄青霉素50.0μg·mL-1处理发病率为54.7%,单用多菌灵50.0μg·mL-1为50.7%,均明显高于对照发病率34.7%。  对致病力弱化的菌株进行处理后,真空冷冻干燥处理的致病力最高,发病率为94.7%,20℃恒温干燥处理36h发病率接近真空冷冻干燥,为90.7%,30℃恒温干燥处理发病率为79.3%,显著高于对照发病率34.7%,10℃、40℃处理后孢子囊叶片点接发病率均低于对照。  无菌繁殖材料以巨峰品种为最佳,在没有寄主材料的季节繁殖保存葡萄生单轴霉,可用组培苗的叶片来进行保存,增加孢子囊的保存时间。  自然发病的材料在处理前叶面点接生物测定病菌的发病率为91.3%,真空冷冻干燥后,发病率平均值为95.3%,说明真空冷冻干燥并未引起病菌发病率的降低,且冷冻干燥后病菌致病力较高,适合作为长期保存材料。在-65℃低温保存时,真空封存保存材料80 d后孢子囊叶片点接发病率仍达到68.0%,高于直接分装的发病率37.3%。研究结果表明,真空冷冻干燥后的病菌材料在-65℃低温保存更有利于长期保存葡萄生单轴霉。  葡萄生单轴霉孢子囊MTT染色的最佳条件为温度36℃,MTT浓度0.05%,染色48 h,孢子囊染色率可达83.0%。20℃恒温干燥处理36h显著提高了孢子囊存活力,葡萄生单轴霉孢子囊的蓝色染色率为79.3%,叶片点接发病率为98.9%,显著高于对照的蓝色染色率52.0%和发病率62.7%。MTT染色得到的孢子囊蓝色染色率与点接生物测定法得出的发病率存在很好的线性关系y=1.2761x-1.9391,R2=0.9961,孢子囊的蓝色染色率与叶片点接发病率呈正相关。本研究表明MTT染色法可以用于葡萄生单轴霉孢子囊存活力的快速和准确检测。
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