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支原体（Mycoplasma）是引起牛呼吸道疾病的重要病原,已经证明丝状支原体丝状亚种SC型（Mycoplasma mycoides subsp.Mycoides SC,MmmSC）、牛支原体（Mycoplasma bovis）、牛眼支原体（Mycoplasma bovoculi）、殊异支原体（Mycoplasma dispar）、牛鼻支原体（Mycoplasma bovirhinis）等多种支原体对牛有致病性。其中,牛支原体在引发牛呼吸道疾病的支原体中感染最为普遍。国内对牛支原体的报道较多,而其他支原体的感染情况尚不清楚。本研究对患呼吸道疾病的病牛进行了牛支原体、牛眼支原体、殊异支原体和牛鼻支原体感染的调查,并建立了牛支原体的恒温隔绝式荧光PCR方法,实现病原精确检测的便捷化、现场化和轻简化。取得成果如下:1.牛呼吸道疾病样本中支原体感染的调查从患有呼吸道疾病的肉牛和牦牛中分别采集54份肉牛鼻腔棉拭子和16份牦牛鼻腔棉拭子,用牛支原体、牛眼支原体、殊异支原体和牛鼻支原体的特异性检测引物对这70份样本进行了检测,调查支原体感染情况;同时采用支原体属的特异性PCR方法扩增长度为1021bp的16S rRNA序列,克隆测序后做进化分析。结果表明:4种支原体特异性检测结果显示,牛支原体在肉牛和牦牛的样本中的感染率分别为57.30%（29/54）和68.75%（11/16）,殊异支原体在肉牛和牦牛的样本中的感染率分别为29.63%（16/54）和56.20%（9/16）,牛眼支原体在肉牛和牦牛样本中的检出率分别为20.37%（11/54）和37.50%（6/16）,牛鼻支原体在肉牛和牦牛中的检出率分别为16.67%（9/54）和25.00%（4/16）。在两种支原体混合感染中,检出率相对较高的是以牛支原体+殊异支原体模式的混合感染,肉牛和牦牛样本中的检出率分别为16.67%（9/54）和50.00%（8/16）;三种支原体混合感染的情况在肉牛和牦牛中都有出现,而四种支原体混合感染的情况只在牦牛样本中被检出。本实验结果表明,国内牛呼吸道疾病样本中支原体感染较为普遍,且种类较多,其中牛支原体检出率最高。首次在国内牛中检出牛眼支原体,丰富了国内牛呼吸道疾病的病原谱。2.牛支原体的分离鉴定及药敏试验采用商品化的支原体基础培养基,对15份牛支原体阳性样本进行了支原体的分离。样本处理后接种液体培养基,于37℃、5%CO2的条件下培养,培养基变色后转接种于固体培养基,于37℃、5%CO2培养箱培养。经过3d培养,出现“煎蛋样”菌落。经三次纯化后得到10株牛支原体纯培养物。药敏试验结果显示,分离的牛支原体对泰乐菌素、氧氟沙星、土霉素、庆大霉素、头孢喹诺、氟苯尼考敏感,而对恩诺沙星和头孢噻呋产生了耐药。本研究结果为牛支原体病的预防和治疗提供了参考。3.检测牛支原体iiPCR方法的建立恒温隔绝式PCR（iiPCR）检测速度快的优势,本研究采用Sachse K等人报道的检测牛支原体的引物与探针,经过反应体系优化,首次建立了牛支原体的恒温隔绝式荧光PCR方法。此方法特异性和稳定性好,对牛支原体参考株（CD-2）以及10株牛支原体分离株均可检出,对溶血性曼氏杆菌、链球菌、无乳支原体、BVDV、BCoV等病原均不检出;最低检测限为44.40copies·μL-1,灵敏性高。配合Pet NAD核酸萃取试剂盒和POCKIT手持核酸分析仪,实现了牛支原体的现场检测,从核酸提取到报告结果仅需1小时,为牛支原体的现场检测提供了可靠的方法。