研究背景与目的:缺血性脑卒中是全球第二大死亡原因和主要致残原因,随着人口的老龄化及高血压、糖尿病等疾病患病率的逐渐攀升,缺血性脑卒中的发病率也在逐年增加,给社会及家庭都带来了沉重的负担。目前针对缺血性脑卒中的治疗主要采取血管再通策略,在一定时间窗内恢复堵塞血管的血流实现再灌注,从而挽救或缩小缺血半暗带。然而恢复血液再灌注后,组织器官损伤可能没有发生改善,反而进一步加重,这种现象称为脑缺血再灌注损伤（Cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI）。炎症反应在CIRI中起到重要作用。在CIRI急性期,炎症细胞的激活、浸润与炎症因子的释放形成相互促进的级联反应,使脑组织由缺血性损伤转变为炎症性损伤。而在炎症亚急性期,机体发生一系列协调且积极的炎症调控反应:在内、外源性炎症介质的介导下,早期浸润的中性粒细胞发生凋亡并被吞噬细胞吞噬清除,使组织逐渐恢复稳态与免疫平衡,这一过程称为炎症消退。炎症消退作用既可以减轻CIRI炎症损伤,也有利于CIRI慢性期的组织修复与神经功能恢复,因此炎症消退期的免疫调节是目前CIRI的潜在治疗手段之一。细胞型朊蛋白（Cellularprionprotein,PrPC）是一种由Prnp基因编码的高度保守的细胞表面糖蛋白,也是朊蛋白病病原体致病型朊蛋白（Scrapie prion protein,PrPSc）错误折叠前的正常结构。人们发现,PrPC虽不影响机体各项生理表型,但PrPC表达缺失的动物不具有发展为朊蛋白病的潜能,因此PrPC也是朊蛋白病研究的重要靶点,深入探究PrPC的生理功能及其参与的细胞过程是非常重要的。PrPC与缺血性脑卒中后的神经保护作用密切相关,既往研究发现PrPC在缺血性脑卒中患者的病灶缺血半暗带区表达上调,通过参与神经细胞信号传导,促进干细胞归巢等机制导致血管与神经再生,然而关于PrPC能否参与CIRI炎症消退过程的调节,以及可否通过影响免疫反应诱导神经保护目前尚无相关研究。因此,本研究旨在探究PrPC的表达变化对于CIRI后炎症消退期机体的神经功能、相关介质及因子介导的免疫环境变化是否发生影响,并对PrPC在CIRI炎症消退过程中参与的免疫细胞事件进行深入探究,以期进一步了解PrPC的生理功能,并挖掘PrPC在缺血性脑卒中发挥神经保护作用的新机制,为缺血性脑卒中的免疫治疗提供新的思路与靶点。研究内容:第一部分 PrPC在小鼠CIRI后炎症消退阶段循环及脑内中性粒细胞与吞噬相关细胞中的表达变化实验方法:1、选择野生型（WT）FVB/N雄性小鼠,构建短暂性大脑中动脉栓塞（Transientmiddlecerebral artery occlusion,tMCAO）模型,采用流式细胞学技术对小鼠tMCAO后1 d时外周血及脑内浸润中性粒细胞及其中PrPC+细胞所占比例进行检测,明确CIRI后PrPC是否在各处中性粒细胞出现表达上调。2、采用流式细胞学技术对WT小鼠tMCAO后3 d外周血单核细胞、病灶侧脑组织浸润的小胶质/巨噬细胞及其中PrPC+细胞所占比例进行检测,明确CIRI后PrPC是否在单核及小胶质/巨噬细胞出现表达上调。实验结果:1、在tMCAO后1d,WT小鼠外周血及病灶侧脑组织浸润中性粒细胞及其中PrPC+细胞比例均显著增加。2、在tMCAO后3d,WT小鼠外周血单核细胞及其中PrPC+细胞、病灶侧脑组织浸润的小胶质/巨噬细胞及其中PrPC+细胞比例均显著增加。第二部分 PrPC对于小鼠CIRI后炎症消退阶段神经功能及介质产生的影响实验方法:1、选择Prnp基因敲除（Prnp K.O.）、Prnp基因过表达（Prnp+/+,tga20）以及WT雄性小鼠,构建tMCAO模型,分别对各基因型小鼠造模后1、3、5、7d小鼠进行Zea Longa神经行为学评分,对不同基因型小鼠评分进行比较,明确PrPC表达改变是否影响CIRI后炎症消退时期小鼠行为学变化。2、检测不同基因型小鼠在tMCAO后3-7 d病灶侧脑组织脂氧素A4（Lipoxin A4,LXA4）、消退素D1(Resolvin D1,RvD1含量,分析二者随时间变化趋势,并对各基因型小鼠在不同时间点二者表达量进行比较。3、检测不同基因型小鼠在tMCAO后3-7 d外周血促炎因子TNF-α、IL-6、IFN-γ以及抗炎因子IL-4、IL-10的含量,分析各炎症因子随时间变化趋势,并对各基因型小鼠表达含量进行比较。实验结果:1、在tMCAO后3-7 d,tga20小鼠的Zea Longa神经行为学评分较WT小鼠明显降低,PrnpK.O.小鼠评分明显升高。2、tMCAO后3-7 d各基因型小鼠病灶半球LXA4、RvD1表达量均明显升高;与WT小鼠相比,tga20小鼠LXA4、RvD1表达量在各个时间点都明显升高,prnp K.O.小鼠均明显降低。3、tMCAO后3-7 d各基因型小鼠外周血促炎及抗炎细胞因子均表现为升高趋势;tga20小鼠促炎因子（TNF-α、IL-6、IFN-γ）未见明显变化,而抗炎因子（IL-4、IL-10）明显升高,Prnp K.O.小鼠促炎因子均明显增加,而抗炎因子则有减少的趋势,未表现出统计学意义。第三部分 PrPC对小鼠CIRI后中性粒细胞趋化、浸润及凋亡的影响实验方法:1、采用RT-qPCR方法对不同基因型小鼠tMCAO后12h病灶侧脑组织中性粒细胞趋化因子Cxcl1、Cxcl2、Cxcl5 mRNA水平进行检测,并分别比较各基因型小鼠各趋化因子mRNA水平差异。2、采用流式细胞学技术对不同基因型小鼠tMCAO后1 d外周血中性粒细胞比例、病灶侧脑组织浸润的中性粒细胞比例进行检测,并对浸润的中性粒细胞进行免疫荧光染色,观察病灶部位中性粒细胞浸润情况,利用ImageJ软件计数后比较各基因型小鼠病灶部位中性粒细胞浸润差异。3、采用流式细胞凋亡技术对不同基因型小鼠tMCAO后1 d病灶侧脑组织凋亡中性粒细胞凋亡情况进行检测,并比较各基因型小鼠病灶侧脑组织中性粒细胞凋亡比例差异。实验结果:1、与WT小鼠相比,tMCAO后12 h时tga20小鼠病灶侧脑组织Cxcl1、Cxcl2 mRNA水平显著降低,Prnp K.O.小鼠二者显著升高;各组小鼠Cxcl5mRNA水平差异未表现出统计学意义。2、外周血中:与WT小鼠相比,tMCAO后1 d时tga20小鼠中性粒细胞比例明显减少,Prnp K.O.小鼠中性粒细胞比例明显增加;病灶侧脑组织:与WT小鼠相比,tMCAO后1 d时tga20小鼠中性粒细胞比例及数量均明显减少,Prnp K.O.小鼠中性粒细胞比例及数量明显增加。3、与WT小鼠相比,tga20小鼠病灶侧脑组织凋亡中性粒细胞比例明显增加,Prnp K.O.小鼠凋亡中性粒细胞比例明显减少。第四部分 PrPC对小鼠CIRI后炎症消退阶段外周单核细胞及病灶半球小胶质/巨噬细胞数量、分型及功能的影响实验方法:1、采用流式细胞学技术对不同基因型小鼠在tMCAO后3-7 d外周血单核细胞及Ly-6Chi亚群分化比例进行检测,对炎症消退时期各时间点比例变化进行动态分析,并对各时间点时不同基因型小鼠细胞比例变化进行比较。2、采用流式细胞学技术对不同基因型小鼠在tMCAO后3-7 d病灶侧脑组织浸润小胶质/巨噬细胞数量及M1、M2亚型极化比例进行检测,对炎症消退时期各时间点细胞比例变化进行动态分析,并对各时间点时不同基因型小鼠各类细胞比例变化进行比较。3、对tMCAO后5 d时各基因型小鼠病灶侧脑组织小胶质/巨噬细胞极化比例（M1%+M2%）及M1、M2型相对比例（M1%/M2%）进行比较,分析不同基因型小鼠在小胶质/巨噬细胞浸润高峰时极化及各表型比例之间的差异。4、对病灶部位凋亡中性粒细胞及小胶质/巨噬细胞进行免疫荧光染色,并采用激光扫描共聚焦显微镜对病灶部位进行断层扫描并对图像进行三维重建,观察二者位置关系,并比较不同基因型小鼠病灶部位被吞噬的凋亡中性粒细胞的比例差异。实验结果:1、tMCAO后3-7 d,各基因型小鼠外周血单核细胞比例及Ly-6Chi亚群比例随着时间变化均呈现逐渐下降趋势;与WT小鼠相比,在各个时间点tga20小鼠外周血单核细胞数量及Ly-6Chi亚群比例均明显升高,Prnp K.O.小鼠均明显下降。2、tMCAO后3-7 d,各基因型小鼠病灶侧脑组织浸润小胶质/巨噬细胞、M1型细胞、M2型细胞比例随着时间呈先升高后下降的趋势,且均在5 d时达到高峰。3、与WT小鼠相比,在各个时间点tga20小鼠小胶质/巨噬细胞、M2型细胞均明显升高、M1型细胞浸润比例均显著下降;Prnp K.O.小鼠在tMCAO后5 d时小胶质/巨噬细胞浸润比例表现出明显的下降,M1型细胞在各个时间点均明显增加,M2型在tMCAO后7 d明显下降。4、tMCAO后5 d,各基因型小鼠病灶侧脑组织浸润小胶质/巨噬细胞极化比例（M1%+M2%）未见明显差异,但tga20小鼠M1%/M2%明显降低,Prnp K.O.小鼠M1%/M2%明显升高。5、tMCAO后5 d,tga20小鼠病灶侧脑组织浸润被吞噬的凋亡中性粒细胞占凋亡中性粒细胞比例明显增加,Prnp K.O.小鼠则明显降低。研究结论:1、CIRI后,外周中性粒细胞、单核细胞以及脑内浸润小胶质巨噬细胞比例增高,PrPC在上述细胞表达水平上调,参与了炎症消退阶段重要的免疫细胞事件。2、CIRI后,高表达的PrPC促进了脑内相关SPMs及外周抗炎细胞因子的产生,使机体免疫环境向促进炎症消退及抗炎方向转化,并且起到减轻缺血性脑卒中症状、促进神经功能恢复的作用。3、CIRI后,高表达的PrPC通过减轻炎症消退期外周血中性粒细胞动员,下调中性粒细胞趋化因子表达,减少中性粒细胞向脑内浸润,并促进脑内浸润中性粒细胞凋亡,起到促进炎症消退作用。4、CIRI后,高表达的PrPC通过促进炎症消退期外周血单核细胞动员及Ly-6Chi细胞亚群分化,增加脑内小胶质/巨噬细胞浸润并促进M2型极化,提高小胶质/巨噬细胞对凋亡的中性粒细胞的吞噬能力,起到促进炎症消退作用。