第一部大鼠原代皮质神经元培养与鉴定目的探讨大鼠原代皮质神经元无血清培养的影响因素及优化方法。方法采用原代神经元无血清培养,按胎鼠组、新生鼠组,胰蛋白酶消化时间0min、5min、15min组,取材环境温度20℃组、30℃组等不同影响因素进行分组。应用台盼蓝拒染法检测接种时神经元存活率,神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)免疫组织细胞化学染色法比较各组所得神经元纯度,倒置显微镜动态观察神经元形态变化。结果胎鼠组和新生鼠组原代神经元状态良好,纯度和存活率均较高；结合环境温度适当调整消化时间可提高神经元细胞纯度和细胞活性；并尽量缩短操作时间。结论24h内新生鼠原代神经元无血清培养操作性强、省时,优化神经元培养过程影响因素可提高神经元细胞的纯度和存活率。第二部戊二酸致原代培养大鼠纹状体神经元神经毒性的体外研究目的探讨戊二酸干预体外培养纹状体神经元致神经元损伤的浓度和时间依赖性及损伤机制。方法体外培养新生大鼠纹状体神经元,于体外培养7d (DIV 7d)行NSE免疫细胞化学染色鉴定神经元纯度,纯度达90%以上。用不同浓度戊二酸孵育体外培养10d纹状体神经元24-96 h, Hoechst 33342 (-/+)荧光活细胞染色后倒置显微镜观察神经元形态变化,MTT法检测细胞线粒体功能变化,Annexin V/PI双染流式细胞仪检测评判戊二酸诱导纹状体神经元损伤类型及程度,TUNEL法及电镜观察细胞形态学变化,实时定量RT-PCR及Western blot初步探讨凋亡相关通路。结果神经元纯度90%以上；戊二酸处理组细胞线粒体功能受损程度呈浓度及时间依赖性改变：随着戊二酸浓度升高、干预时间增长,神经元损伤加重。Annexin V/PI双染流式细胞仪检测凋亡,各时间组内不同浓度组与正常对照比较,50 mmol/L组干预48 h、72 h后凋亡率均比正常对照组显著性增高(40.90±4.09,p=0.00；87.63±9.17,p=0.02),而20mmol/L浓度组干预72h与正常对照组细胞相比差异有显著性(16.27±1.70,p=0.04)；各浓度组内干预时间比较,10、20、50 mmol/L组孵育72 h比48 h细胞凋亡增加有统计学意义(p=0.02,0.01,0.00),各组未见坏死增加。TUNEL法及电镜从形态学上说明处理组神经元呈凋亡改变。戊二酸10、25、50 mmol/L作用神经元1 h、6h caspase-9和caspase-3 mRNA表达明显增加,25、50 mmol/L戊二酸处理24 h后神经元caspase-9、caspase-3蛋白活化片段增加。结论戊二酸致纹状体神经元损伤呈浓度-时间依赖性,通过caspase-9/-3途径诱导纹状体神经元凋亡,该机制可能与戊二酸尿症Ⅰ型纹状体退行性变有关。第三部NMDA受体拮抗剂MK-801对戊二酸致神经元损伤的保护作用目的研究戊二酸处理体外培养纹状体神经元致神经元损伤的机制及NMDA受体在其中的作用。方法体外培养新生大鼠纹状体神经元,于体外培养7d (DIV 7d)行NSE免疫细胞化学染色鉴定神经元纯度,纯度达90%以上。有／无NMDA受体拮抗剂预(共)孵育后,用不同浓度戊二酸孵育体外培养10 d纹状体神经元24 h, MTT法检测细胞线粒体功能变化,Annexin V/PI双染流式细胞仪检测评判戊二酸诱导纹状体神经元损伤类型及程度,Western blot初步探讨凋亡相关通路。实时定量PCR检测NMDA受体亚单位(NR1、NR 2A、NR 2B) mRNA表达水平变化。结果神经元纯度90%以上；戊二酸处理组细胞线粒体功能受损程度呈浓度依赖性改变,NMDA受体拮抗剂MK-801可增强10、20、50mmol GA处理组的细胞活力。Annexin V/PI双染流式细胞仪检测凋亡,30、50mmol/L组干预24h细胞凋亡率比正常对照组显著性增高(41±2.66,46.97±2.47；p＜0.01),MK-801共孵育组比同浓度GA处理组凋亡率显著性降低(30.23±1.27,28.37±3.32；p<0.01),而CNQX组未能减少细胞凋亡,然而三组细胞凋亡率均比正常对照组显著增高(p<0.01); 30 mmol/L戊二酸处理24h后神经元caspase-9、caspase-3蛋白活化片段增加,MK-801能减弱该活化片段的表达。NR1、NR 2B mRNA在不同浓度戊二酸作用下有不同程度表达减低,而NR 2A mRNA表达未见明显变化。结论戊二酸通过caspase-9/-3途径以浓度-时间依赖诱导纹状体神经元凋亡,且此毒性作用与NMDA受体(尤其NR1、NR 2B受体亚单位)有关,该机制可能与戊二酸尿症Ⅰ型纹状体退行性变有关。第四部分慢性皮下注射戊二酸诱导大鼠纹状体损伤机制的初步研究目的研究慢性颈背部皮下注射戊二酸致大鼠纹状体损伤及可能的机制。方法新生大鼠于生后低2 d随机分为正常对照组(NS)、低剂量组(LGA)及高剂量组(HGA),并于生后第3 d开始以5μmol·g-1体重的剂量颈部皮下注射生理盐水(NS)、戊二酸(HGA组按10μmol·g-1),早中晚3次注射。连续给药20 d,最后一次给药后12 h,麻醉后心脏灌注4%多聚甲醛固定,取脑观察大体形态改变,于冠状位及矢状位切至纹状体层面行HE染色及TUNEL染色,检测纹状体神经细胞损伤。实时定量PCR检测未经固定纹状体组织caspase-3、8、9、Bax、Bcl-2 mRNA表达水平变化、Western blot检测caspase-3蛋白酶原及活化片段表达水平。结果生后3d LGA组、HGA组乳鼠体重与生理盐水组无明显差异,随着处理时间的推移,LGA组、HGA乳鼠体重低于生理盐水组,以HGA组乳鼠体重降低更明显：LGA组用药后11d体重明显低于NS组(p<0.01),而HGA组用药后4-20 d体重明显低于NS组。3只HGA组有2只出现大脑半球向脑室塌陷,皮质变薄,基底神经节与皮质间未见明显的纤维连接,易与皮质分离,而NS组及LGA组乳鼠大脑未见明显结构异常,NS组乳鼠大脑饱满,有弹性,皮质和基底神经节间可见大量白色纤维连接。HE染色发现HGA组间质水肿,细胞空泡样变,血管周围间隙增宽,细胞结构混乱。LGA组、HGA组TUNEL染色可见纹状体区细胞大量棕黄色颗粒沉淀于细胞内,aspase-3、9、Bax mRNA表达上调,而抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达减低,caspase-8 mRNA表达未见增高,caspase-3蛋白酶原及活化片段表达增加。结论长期慢性皮下注射戊二酸致纹状体损伤,且线粒体途径诱导纹状体细胞凋亡可能与纹状体损伤有关。