创伤、新陈代谢疾病和关节感染等引起的关节软骨缺损已成为临床常见疾病之一。成熟的关节软骨没有血管组织,因此,一旦损伤,其自我修复能力非常有限。传统治疗关节软骨缺损和疾病的方法如关节清创术、微骨折技术和软骨移植等都存在各自的一些缺陷,例如,微骨折技术不能完全修复软骨组织,软骨移植存在供体有限的局限。因此,寻求可靠、安全和有效的修复软骨缺损的方法具有重要的意义。近年来,利用组织工程的方法修复、替代受损软骨组织为治疗软骨缺损和疾病带来了新的思路。组织工程软骨支架作为种子细胞临时生长的微环境,在软骨组织工程中扮演了非常重要的角色。理想的软骨组织工程支架应提供一定的力学支撑,可以仿生天然软骨细胞外基质的结构,模拟软骨细胞生长的微环境,利于软骨细胞等种子细胞的粘附、生长和增殖,从而促进软骨缺损的修复。纳米纤维结构的支架被认为可以仿生天然细胞外基质的结构,而传统制备纳米纤维支架的主要制备方法主要有静电纺丝、相分离和自组装等。但是这些技术都有自身的不足和局限,例如,静电纺丝技术的优势在于制备二维结构的纳米纤维膜,在制备三维结构的纳米纤维支架方面仍然面临挑战。针对传统纳米纤维支架制备技术的不足,本课题将静电纺技术与冷冻干燥技术相结合,以gelatin和pla两种生物相容性优异的可降解材料为支架构建材料,制备出gelatin占主体的纳米纤维三维多孔支架。三维支架的制备思路可概括为:(1)静电纺丝制备gelatin与pla复合的纳米纤维膜;(2)将纤维膜剪碎,置于叔丁醇中利用高速匀浆机将纤维分散均匀;(3)冷冻干燥成型;(4)交联三维支架;此外,对三维支架进行功能化修饰以进一步提高三维支架的生物相容性。然后,表征三维支架的理化性能,检测三维支架的细胞相容性。最后,评价三维支架植入动物体内后修复关节软骨的效果。首先,我们制备了基于戊二醛交联的gelatin/pla纳米纤维多孔支架,验证静电纺丝与冷冻干燥相结合的三维支架制备技术的可行性。通过控制物料含量制备了不同密度的三维支架,随着物料含量的增大,三维支架因戊二醛交联导致的体积收缩率降低。由扫描电子显微镜(sem)观察到三维支架的纤维形貌和多孔结构,表明支架具有仿生天然细胞外基质(ecm)的效果。吸水率实验测试表明三维支架具有优异的吸水性能,且最大吸水率随着物料含量的增加而降低。分别对干态下和湿态下的三维支架进行压缩力学测试,结果表明,随着支架物料含量的增加,三维支架的力学强度增加,此外,湿态下的三维支架呈现出压缩弹性,在一定的压力下将支架压缩至80%形变,当撤掉外力时,支架又可以吸水慢慢恢复原状。将三维支架与成纤维细胞共培养,通过mtt增殖实验表明三维支架可以促进成纤维细胞的生长和增殖,通过sem观察表明细胞在支架上生长可以保持很好的细胞形貌,通过对支架进行切片和he染色,可以观察到细胞已经长入到支架的内部。因此,实验结果表明静电纺技术与冷冻干燥技术相结合制备组织工程支架的方法具有可行性。然后,为了避免gelatin/pla三维支架因戊二醛交联带来的毒性,我们采用热交联和水处理两步法代替戊二醛交联。探讨了不同加热温度对三维支架力学和支架形貌稳定性的影响,找到了合适的热交联温度。研究发现热处理后三维支架的力学强度增加,而当热处理支架吸水后再次冷冻干燥后,其力学强度将进一步提高。两步法处理的三维支架与戊二醛交联支架相似,具有纳米纤维构成的多孔结构、优异的吸水性能和湿态下的压缩弹性。细胞实验表明,三维支架可以促进软骨细胞的生长和增殖,保持较好的细胞活性,表明热交联三维支架具有较好的生物相容性。为了进一步模拟天然软骨基质的化学组成,我们对gelatin/pla三维支架进行修饰,将透明质酸(ha)通过edc/nhs接枝于三维支架纤维的表面。研究发现三维支架经ha修饰后其密度增加,而纤维形貌和吸水性能变化不大。压缩力学表明三维支架经ha修饰后,无论是在干态下还是湿态下,支架的压缩力学强度都显著提高,表明ha的加入使得三维支架的―硬度‖增强。为了评价三维支架在动物体内修复关节软骨缺损的效果,我们制造新西兰大白兔关节软骨缺损模型,并将ha修饰支架和未修饰支架分别植入软骨缺损处。动物实验结果表明,经ha修饰的三维支架可以明显促进大白兔关节软骨缺损的修复,而未修饰三维支架修复软骨缺损的效果一般。最后,我们制备了一种主要由槽状纤维构成的三维多孔支架。该支架是利用同轴静电纺技术制备PLA位于芯层,Gelatin位于壳层的PLA@Gelatin纳米纤维膜。纳米纤维膜在高速匀浆机的力学搅拌作用下,PLA从纤维内部脱离,从而形成槽状Gelatin短纤维和PLA纤维,以此为材料构成的三维支架由热交联和水处理后同样具有多孔结构,优异的吸水性能和湿态下压缩弹性。我们进一步对PLA@Gelatin三维支架进行功能化修饰,选用软骨基质中含有的另一种成分——硫酸软骨素(CS)通过EDC/NHS接枝于支架纤维表面。实验发现,经CS修饰后的支架可以促进骨髓间充质干细胞(BMSC)向软骨细胞分化,此外,动物结果表明,CS修饰支架比未修饰支架更有利于新西兰大白兔关节软骨缺损的修复。综上所述,我们利用多种技术相结合制备出了多种仿生软骨组织工程支架。静电纺技术制备出纳米纤维,具有仿生软骨ECM的效果;匀浆技术和冷冻干燥技术则将纤维重新定形,保证支架具有形状可控的三维结构;通过交联则使支架获得稳定的纤维形貌和力学性能;三维支架的功能化修饰则进一步提高其生物相容性和软骨修复能力。因此,Gelatin与PLA复合三维纳米纤维多孔支架有望应用于软骨组织的修复和再生。