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杂色鲍(Haliotis diversicolor)属于腹足纲鲍科(Haliotidae)的单壳海生贝类。是我国东南沿海鲍科中最重要的经济养殖种类之一。高水温和缺氧,不仅会造成杂色鲍的大量死亡,同时也会对鲍鱼养殖业的健康发展产生较大的影响。通常情况下,机体会通过自身的调节来适应这些不利的环境条件的变化。由于杂色鲍缺乏获得性免疫系统,因此这一适应的过程在很大程度上就依赖于机体的先天免疫系统。作为参与先天免疫调节的重要信号通路,NF-κB信号通路也必然在这一过程中发挥着至关重要的作用。本研究利用SMART-RACE技术,同时依托于简并引物的扩增以及转录组EST数据库的查找成功克隆获得4条参与到NF-κB信号通路中的先天免疫调控相关基因:核因子κB抑制因子(NF-kappa-B inhibitor,IκB)、Akirin2、酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白ζ(Tyrosine 3/Tryptophan 5 monooxygenase activation protein zeta,14-3-3ζ)、脑富集的Ras蛋白同源体(Ras homologenriched in brain,RHEB),并分别命名为SaIκB、SaAkirin2、Hd14-3-3ζ和HdRHEB。同时,利用不同的生物信息学方法分析了杂色鲍的SaIκB、SaAkirin2、Hd14-3-3ζ和HdRHEB基因的特征。利用实时荧光定量PCR技术,本研究分析了若干NF-κB信号通路相关基因在杂色鲍缺氧、高温以及高温&缺氧联合应激等不同环境因子刺激后在不同时相的表达情况。此外,我们还利用RNA干扰技术对SaIκB干扰后,其它NF-κB信号通路相关基因的表达情况进行了分析。主要的研究结果如下:(1)SaIκB的cDNA全长为1748 bp,编码401个氨基酸。SaIκB基因在所检测的杂色鲍不同组织中均有表达,其中在鳃中的表达量显著性的高于其他各组织。在缺氧诱导条件下,鳃中SaIκB的表达量在4 h和96 h时显著上调(P<0.05);血细胞中SaIκB的表达量则分别在24 h、96 h和192 h时实验组与对照组相比表现出显著性差异(P<0.05)。但是,在高温应激条件下,SaIκB在鳃中的mRNA表达水平只在第6时相才显著性上调(P<0.05),在血细胞也只有在第5时相才检测到了这一显著性差异(P<0.05)。在高温&缺氧联合应激条件下,SaIκB mRNA在鳃中的表达量在4 h和24 h时显著上调(P<0.05),但是在血细胞中只有在4 h检测到了这一变化(P<0.05)。(2)SaAkirin2的cDNA全长为1452 bp,编码187个氨基酸。qRT-PCR显示,该基因在所检测的杂色鲍不同组织中均有表达,其中在肝胰腺中的表达量显著高于除外套膜以外的其它各组织。在缺氧诱导条件下,鳃中SaAkirin2的表达量只有在192 h时实验组与对照组相比表现出显著性差异(P<0.05);而在血细胞中SaIκB的表达量则是分别在缺氧诱导后的4 h、96 h和192 h时显著上调(P<0.05)。高温应激后,SaAkirin2在鳃中的mRNA表达水平只有在第6时相才显著性上调(P<0.05),在血细胞则是在第5时相和第6时相均检测到了这一显著性差异(P<0.05)。在高温&缺氧联合应激条件下,SaAkirin2 mRNA在鳃中的表达量在24 h和192 h时显著上调(P<0.05),在血细胞中则是分别在4 h和96 h时显著上调(P<0.05)。(3)Hd14-3-3ζ的cDNA全长为3010 bp,编码272个氨基酸。Hd14-3-3ζ基因在杂色鲍各组织中均有表达,并且,在肝胰腺中的表达量显著高于除血细胞以外的其他各组织(P<0.05)。在缺氧诱导条件下,鳃中Hd14-3-3ζ的表达量在4 h时显著上调,在24 h时,表达量继续上升达到顶峰,随后,表达量下调,并在192 h时达到与对照组相同的水平。在缺氧诱导的起始阶段,Hd14-3-3ζ在杂色鲍血细胞中的表达量虽有所上升,但与对照组相比不存在显著性差异,在24 h时,实验组的表达量显著上调,在96 h时,差异显著(P<0.05)。高温应激开始阶段,Hd14-3-3ζ在鳃中的表达量不存在显著性差异(P>0.05)。直到第5时相时,表达量出现了显著性上调。在血细胞中,整个应激阶段Hd14-3-3ζ的表达量均不存在显著性差异(P>0.05)。高温&缺氧联合应激条件下,各时期内Hd14-3-3ζ在实验组鳃中的表达量均高于对照组,并且在4 h、24 h和96 h时呈现出显著水平(P<0.05)。在血细胞中,各时期均未检测到显著性差异。(4)HdRHEB的cDNA全长为1044 bp,编码的氨基酸数为182个,并且在外套膜中具有较高的表达量(P<0.05)。在缺氧诱导条件下,在鳃组织中,实验组HdRHEB的表达量在处理后的4 h、24 h和96 h时显著性高于对照组(P<0.05),而在192 h时,实验组和对照组的表达量无显著差异;在血细胞中,实验组HdRHEB的表达量在除4 h以外的其它各时相与对照组相比均显著性上调(P<0.05)。高温应激条件下,鳃中HdRHEB的表达量在第1时相和第2时相实验组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。在第3和第4时相时,实验组中HdRHEB的表达量出现了显著性下调,随后,在第5时相和第6时相这一差异消失。在血细胞中,整个应激阶段实验组HdRHEB的表达量均显著低于对照组(P<0.05)。高温&缺氧联合应激条件下,杂色鲍鳃中HdRHEB mRNA的表达水平分别在24 h和96 h时显著上调(P<0.05),在血细胞中则是在整个应激阶段,实验组的表达量显著高于对照组(P<0.05)。(5)从转录组EST数据库中筛选获得了其它若干杂色鲍NF-κB信号通路相关基因:核因子κB(Nuclear factorκB,NF-κB)、B细胞淋巴瘤因子10(B-cell lymphoma leukemia 10,BCL10)、白介素-1受体相关激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase 4,IRAK4)、丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶7(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 7,TAK1)、髓样细胞分化蛋白88(myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88)、NF-kappa-B抑制剂相互作用的Ras样蛋白2(NF-kappa-B inhibitor-interacting Ras-like protein 2,NKIRAS2)、NF-kappa-B抑制因子(nf-kappa-b-repressing factor,NKRF)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor 6,TRAF6),肿瘤坏死因子受体相关因子2(TNF receptor-associated factor 2,TRAF2)、toll样受体2(toll-like receptor 2,TLR2)、toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)、toll样受体6(toll-like receptor 6,TLR6)、硫氧还蛋白(thioredoxin,TXN)、硫氧还蛋白2(thioredoxin 2,TXN2)、硫氧还蛋白5(thioredoxin domain-containing protein 5,TXNDC5)、硫氧还蛋白17(thioredoxin domain-containing protein17,TXNDC17)和羟苯基丙酮酸双加氧酶(hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPD)依次命名为AbNF-κB、HdBCL10、HdIRAK4、HdTAK1、HdMYD88、HdNKIRAS2、HdNKRF、HdTRAF6、HdTRAF2、HdTLR2、HdTLR4、HdTLR6、HdTXN、HdTXN2、HdTXNDC5、HdTXNDC17和HdHPD。在高温、缺氧以及高温&缺氧联合应激等不同刺激处理下的杂色鲍鳃组织以及血细胞中,上述基因的表达量在不同的时相都有不同程度上的显著变化(P<0.05)。利用Cluster软件对这些基因在不同应激下的表达情况进行了分层聚类分析。在利用RNA干扰技术抑制SaIκB后,上述所有基因的表达情况与绿色荧光蛋白组以及空白对照组相比也均有不同程度的显著变化(P<0.05)。同时本研究还利用Cytoscape分别构建了这些基因在不同应激条件下的96 h和RNA干扰SaIκB后的相互作用网络。