论文部分内容阅读
绞股蓝总皂苷(Gypenoside,Gyp)是葫芦科植物绞股蓝(Gyrostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino,GP)的主要活性成分。它具有抑制肿瘤、防止衰老、降低血脂、增强免疫、保护心脏和肝脏、降低血糖、镇静止痛及抗溃疡等药理作用。其体内外研究结果表明,Gyp具有时间和剂量依赖性的抑制多种肿瘤细胞增殖,且诱导细胞凋亡与抑制增殖呈正相关。本论文研究了Gyp对小鼠白血病细胞株L1210的增殖抑制、细胞凋亡及周期阻滞的作用,并对其机制进行了初步探讨。研究结果为中药开发和肿瘤治疗提供了科学理论依据。本研究包括两章,第一章从已经建立的体外培养的小鼠白血病L1210细胞系,研究Gyp对L1210细胞增殖抑制和诱导细胞凋亡作用,对L1210细胞周期阻滞的作用,对细胞DNA损伤作用,对细胞核形态学的改变,对线粒体膜电位、活性氧的产生、细胞内钙离子的影响；第二章利用自由基清除剂NAC进一步研究了活性氧对细胞增殖的影响,对细胞周期阻滞和线粒体膜电位的影响,以及Gyp诱导细胞色素C的释放和Bax转定位,诱导线粒体凋亡途径中caspase级联反应的激活。1.Gyp对L1210细胞增殖抑制及凋亡作用采用MTT比色法观察Gyp对L1210细胞株增殖的抑制作用；采用流式细胞术检测Gyp对L1210细胞增殖周期的影响；采用DAPI染色和荧光显微镜技术观察Gyp对细胞核形态学的改变；采用单细胞凝胶电泳和荧光显微镜技术检测Gyp对细胞DNA损伤的影响；采用流式细胞术检测Gyp对L1210细胞凋亡作用的影响；利用流式细胞术检测Gyp对L1210细胞线粒体膜电位、活性氧的产生、胞内钙离子含量的影响。2.Gyp对L1210细胞凋亡作用相关机制的研究采用MTT比色法检测NAC对用药后L1210细胞增殖的影响；采用流式细胞术,观察NAC对Gyp处理后L1210细胞周期阻滞以及线粒体膜电位变化的影响；采用间接免疫荧光技术和激光共聚焦技术检测Gyp对细胞色素C的释放和Bax转定位的影响；利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot技术观察Gyp对凋亡执行蛋白caspase-9、3表达的影响。主要实验结果如下：1.Gyp抑制L1210细胞增殖和诱导细胞凋亡在体外培养小鼠白血病L1210细胞,Gyp可显著抑制细胞的生长,且呈明显的剂量和时间依赖性,药物作用24h后的半数抑制浓度(IC50)为350μg/mL。流式细胞仪分析L1210细胞各组细胞周期的主要表现为S期细胞比例增高,G0/G1期和G2/M期细胞数量减少,细胞周期阻滞在S期。在荧光显微镜下观察,经DAPI染色后,L1210细胞核染色质固缩和碎裂等形态改变,具有时间依赖性。单细胞凝胶电泳观察到Gyp对L1210细胞DNA有损伤,药物作用12h后DNA损伤明显；流式细胞术AnnexinV/7-AAD测定发现Gyp诱导细胞凋亡。Gyp可诱导L1210细胞线粒体膜电位下降,具有时间依赖性；低浓度Gyp可清除活性氧,高浓度Gyp诱导活性氧的产生,呈剂量依赖性。Gyp作用细胞后,流式细胞仪检测胞内钙离子浓度发生变化,胞内钙离子浓度随时间延长而增加。2.Gyp诱导L1210细胞凋亡相关作用机制MTT法检测自由基清除剂NAC对抗Gyp对L1210细胞的增殖抑制；流式细胞仪分析NAC可解除Gyp引起的L1210细胞周期s期阻滞,以及Gyp诱导L1210细胞凋亡过程中引起的线粒体膜电位降低；表明在药物诱导L1210细胞凋亡的过程中启动了关键因子活性氧。利用间接免疫荧光法和激光共聚焦显微镜观察到Gyp作用L1210细胞24h后,细胞色素C从线粒体释放到胞质,Bax从细胞质转定位到线粒体。表明Western blot技术观察到Gyp增高了对蛋白caspase-9、3表达水平,并具有时间依赖性。Gyp抑制小鼠白血病L1210生长是通过抑制肿瘤细胞增殖、改变细胞周期,通过线粒体途径来诱导肿瘤细胞凋亡等途径来实现的。结论：Gyp对小鼠白血病L1210细胞具有明显的抗肿瘤作用,作用机制为Gyp引起细胞氧化应激,胞内活性氧增加,导致细胞DNA受损,引起细胞周期阻滞在s期。同时,Gyp诱导产生的活性氧引起线粒体损伤,线粒体膜电位下降,胞内钙离子浓度升高,Bax蛋白转定位至线粒体,导致线粒体膜进一步崩解,细胞色素C释放,引起下游caspase级联反应,最终致使细胞凋亡。