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目的:从RNA甲基化表观遗传学角度,研究6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修饰在环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)诱导未成熟睾丸发育损伤中的作用,并探讨去甲基转移酶脂肪与肥胖相关蛋白(Fat mass and obesity-associated protein,FTO)介导的m6A修饰在DEHP代谢产物邻苯二甲酸单-2-乙基己酯(Mono-2-ethylhexyl phthalate,MEHP)致睾丸间质细胞损伤中的作用机制。1方法:第一部分:将雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠在出生后(Postnatal day,PND)22天至PND 35的青春前期阶段进行灌胃建模,对照组予玉米油灌胃,DEHP暴露的D250组和D500组分别采用250mg/kg·d和500 mg/kg·d剂量DEHP灌胃。(1)采用苏木精-伊红染色、酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)等技术,分别检测SD大鼠在PND36时未成熟睾丸的组织形态、睾酮水平、生精标志物蛋白水平,并采集SD大鼠成年后在PND 90时的附睾组织,检测精子畸形率,综合评价DEHP暴露所致的未成熟睾丸发育损伤;(2)采用比色法、WB、原位细胞凋亡检测等技术,检测未成熟睾丸组织中总抗氧化能力、Nrf2抗氧化信号通路以及凋亡相关蛋白的表达情况,明确其中氧化应激状态和细胞凋亡发生情况;(3)采用比色法和实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,q PCR)技术分别检测未成熟睾丸RNA中总m6A修饰水平和m6A修饰重要调节基因的表达变化,利用RNA甲基化免疫共沉淀(Methylated RNA immunoprecipitation,Me RIP)q PCR技术检测Nrf2 m RNA中m6A修饰富集情况,分析m6A修饰在DEHP致未成熟睾丸发育损伤中的作用。第二部分:采用小鼠睾丸间质细胞TM3细胞系,首先分别使用梯度浓度MEHP和去甲基转移酶FTO抑制剂FB23-2处理TM3细胞24h,通过CCK8实验检测细胞活力,确定适用于本研究的处理浓度。(1)采用q PCR和WB技术检测200μM MEHP对TM3细胞m6A修饰相关调节基因表达的影响;(2)分别以0.1%DMSO、200μM MEHP和20μM FB23-2处理TM3细胞,依次设置为对照组、MEHP组和FB23-2组,采用ELISA、流式细胞技术和比色法,分别检测睾酮含量、细胞凋亡情况和m6A修饰水平,评价MEHP和FB23-2对睾丸间质细胞睾酮合成、凋亡、m6A修饰的影响;(3)利用高通量测序技术,联合生物信息学分析,通过转录组测序研究评估MEHP、FB23-2损伤睾丸间质细胞涉及的分子机制;(4)通过Me RIP测序技术探究FTO受抑制所介导的m6A修饰上调在睾丸间质细胞损伤过程中的关联机制。结果:第一部分:(1)与对照组相比,D250组和D500组的雄性SD大鼠在PND 36时,睾丸组织形态学发生改变,生精小管直径(P<0.001,P<0.001)和生精细胞层数(P<0.01,P<0.001)均显著减小;睾丸睾酮水平显著降低(P<0.001,P<0.001);生精标志物Plzf和Stra8在D250组(P<0.01,P<0.001)和D500组(P<0.001,P<0.001)中表达显著下降;在PND 90时,精子畸形率显著增加(P<0.05,P<0.001)。(2)PND 36时,D250组和D500组的未成熟睾丸与对照组相比,总抗氧化能力显著降低(P<0.05,P<0.001),抗氧化转录因子Nrf2蛋白表达显著下降(P<0.05,P<0.01),其介导的抗氧化信号通路受到不同程度的抑制;睾丸组织中凋亡细胞数量均显著增加(P<0.001,P<0.001),凋亡信号通路中Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Bax等重要蛋白的表达也发生改变。(3)从m6A修饰调控角度,与对照组相比,D250组和D500组SD大鼠在PND 36时未成熟睾丸组织中RNA整体m6A修饰水平显著增加(P<0.01,P<0.001),RNA甲基化调节基因FTO表达显著降低(P<0.001,P<0.001)、YTHDC2表达显著升高(P<0.001,P<0.001);Nrf2 m RNA中3个位点的m6A富集在D250组(P<0.001,P<0.001,P<0.001)和D500组(P<0.001,P<0.001,P<0.001)都较对照组增加,且各个位点的m6A富集水平随DEHP暴露浓度升高而增加(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。第二部分:采用200μM MEHP和20μM FB23-2分别处理TM3细胞后,细胞活力分别为90.588±5.667%和100.991±4.343%。(1)以200μM MEHP处理TM3细胞显著降低FTO在m RNA(P<0.01)和蛋白水平(P<0.05)的表达。(2)TM3细胞分别在200μM MEHP和20μM FB23-2处理后,与对照组相比,细胞培养上清液中睾酮含量均显著下降(P<0.05,P<0.001)、细胞凋亡水平均显著增加(P<0.05,P<0.001)、m6A修饰比例均显著升高(P<0.001,P<0.001)。(3)通过对转录组测序结果分析发现,在分别接受MEHP和FB23-2处理后的TM3细胞中共发现212个重叠的差异表达基因;重叠基因共同在DNA复制(GO:0006260)、细胞周期(mmu04110)、激酶活性的调节(GO:0043549)、细胞死亡正向调控(GO:0010942)、Trp53调节(TRR01554)、凋亡信号途径(GO:0097190)等注释中显著富集。(4)通过Me RIP测序分析分别接受MEHP和FB23-2处理后的TM3细胞,均找到经典的RRACH基序(P<0.001,P<0.001);从两组中总共鉴定出87个重叠的m6A修饰上调基因;重叠的m6A修饰上调基因在组蛋白乙酰化(GO:0016573)、活性氧生物合成过程(GO:1903409)、MAPK信号通路(mmu04010)、激素分泌的正向调节(GO:0046887)、自噬的正向调节(GO:0010508)、雄性性腺发育(GO:0008584)等注释中显著富集。结论:RNA甲基化m6A修饰参与调控青春前期DEHP暴露导致的SD大鼠未成熟睾丸发育损伤作用。FTO受抑制导致m6A修饰上调参与MEHP诱导的睾丸间质细胞损伤过程,且在m6A修饰上调介导的睾丸间质细胞损伤中可能涉及多个生理过程失调。