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牛病毒性腹泻病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease,BVD/MD）又称为牛黏膜病,是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,BVDV）造成的母牛繁殖障碍,犊牛严重腹泻,鼻镜、食道溃疡糜烂,胎牛免疫抑制,持续性带毒排毒,且在全世界流行的一种牛呼吸道、消化道系统疾病。BVDV在病牛与其他动物接触的同时,通过基因重组、变异等已实现跨宿主传播。近年来,不断有鹿、猪、羊感染BVDV的报道,这也使得我国在BVDV的防治上面临更严峻的挑战。接种疫苗是有效防控BVDV的手段,国内目前已有商品化的灭活疫苗上市,起到一定的保护作用,然而灭活疫苗保护周期较短,需要长期不间断免疫。因此,研制新型、安全的活疫苗仍是BVDV疫苗研究的重点内容。本研究通过PCR方法对实验室分离保存的BVDV NM株进行全长序列扩增,拼接后获得BVDV NM株全长12307bp。基因组编码区为第387-12080位,Npro、Core、Erns、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B长度分别为504、306、681、585、1122、210、3408、192、1041、1488、2157bp。与实验室分离保存的非细胞病变型JL株相比,二者同源性为79.9%。对NM株全长进行同源性和进化分析显示,BVDV NM株与中国山东BVDV Singer Arg分离株同源性最高,为99.98%,表明BVDV NM株可能为中国山东Singer Arg株突变而来。RNA二级结构预测后发现,NM株5’及3’端均含有Y型发卡结构,而JL株无发卡结构。JL株与NM株E2蛋白含有大量磷酸化修饰位点与糖基化位点,但其修饰位点差异较大。为了验证病毒拯救系统所需调控元件的正确性,本实验构建了微基因组系统。该系统基于p CI-neo载体,采用overlap PCR方法分别融合锤头状核酶、BVDV NM株5’UTR、EGFP报告基因、BVDV NM株3’UTR和丁型肝炎核酶。在送至生物公司鉴定序列正确后,转染细胞以验证末端序列的调控区和启动元件能否正常发挥功能。转染微基因组48h后,通过荧光倒置显微镜可观察到绿色荧光,表明病毒拯救系统所需的调控元件构建成功。综上所述,本研究对BVDV NM株进行了PCR扩增、序列测定及生物信息分析,构建并验证了包含该毒株启动元件的微基因组,为建立BVDV NM株反向遗传操作系统提供了前期基础。