论文部分内容阅读
背景食管癌（esophageal cancer,ESCA）的发病率在全球排名第七,死亡率排名第六。中国的食管癌发病率居世界前五位。食管癌的两种主要组织学类型为食管腺癌（esophageal adenocarcinoma,EAC）和食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）。在中国最常见的是ESCC。虽然在诊断和治疗方面均取得了进步,但患者的5年生存率仍低于30%,因此亟待探索新型治疗靶点及高效治疗方式。RNA N6-甲基腺嘌呤修饰（N6-methyladenenosine,m6A）是RNA主要的甲基化修饰类型,参与多种癌症的发生与发展。已有研究报道m6A修饰调控因子通过修饰pri-miRNAs,影响 DiGeorge 综合症关键区域基因 8（DiGeorge syndrome critical region 8,DGCR8）等微处理复合物分子对其的识别与处理,调控下游miRNAs的合成,参与包括肿瘤在内多种疾病的进程。而关于m6A去甲基化酶参与该过程的研究甚少。脂肪和肥胖相关基因（fat mass and obesity-associated protein,FTO）是第一个被发现的m6A去甲基化酶,已被报道参与急性髓系白血病、黑素瘤、乳腺癌和肺癌等多种肿瘤的发展。另外,已开发的FTO小分子抑制剂在所有m6A修饰调控因子中是最多的,提示其在临床转化方面拥有巨大潜力。FTO在ESCC中的作用以及是否影响miRNA的合成过程尚待研究。目的1.研究FTO在ESCC中的表达情况及其临床意义;2.研究FTO对于ESCC生物学功能的影响;3.研究FTO在ESCC中发挥作用的具体分子机制。方法1.探究FTO在ESCC中的表达情况及其临床意义利用 TCGA-ESCA（the cancer genome atlas-esophageal cancer,TCGA-ESCA）数据库探索多种m6A修饰调节因子在ESCC、EAC以及癌旁组织中的表达情况,并寻找具有ESCC表达特异性的分子。使用ESCC患者的临床标本检测ESCC及癌旁组织中m6A水平及FTO表达水平的差异;评估FTO表达与各病理指标及患者生存期之间的关系。2.FTO在ESCC中的生物学功能鉴定2.1建立过表达/敲降FTO的ESCC细胞系。2.2利用细胞增殖曲线、克隆形成实验及裸鼠皮下异种移植瘤模型评估FTO对ESCC增殖功能的影响。利用transwell实验、细胞划痕实验、检测EMT分子表达的Western blot实验、ESCC静脉转移动物模型评估FTO对ESCC侵袭、迁移及转移功能的影响。2.3利用FTO小分子抑制剂干预FTO的过表达以补充对FTO的遗传学干预,检测FTO在被抑制剂干预后对ESCC增殖、侵袭迁移及转移功能的影响。2.4利用野生型及去甲基化催化活性突变型的FTO质粒行FTO挽救实验,以探究FTO发挥作用是否依赖其去甲基化酶活性。3.FTO的作用机制探索3.1利用TCGA-ESCA数据库预测FTO的下游miRNA及其pri-miRNA,并在细胞中验证。3.2 利用 RNA 结合蛋白免疫沉淀实验（RNA binding protein immunoprecipitation,RIP）探究FTO对pri-miRNA m6A水平及DGCR8结合水平的影响。3.3利用miRNA簇挽救实验验证FTO是否通过miRNA簇影响ESCC的增殖、侵袭等功能。3.4利用FTO挽救实验,探究FTO是否依赖其去甲基化酶活性影响miRNA簇的加工过程。3.5确定miRNAs的靶基因:利用TCGA-ESCA数据库及miRDB数据库（https://www.mirdb.org）预测miRNA簇的靶基因,并在miRNA簇挽救实验中验证。3.6在细胞及移植瘤中验证FTO是否调控上述靶基因的表达。3.7利用FTO挽救实验验证FTO对靶基因调控是否为m6A依赖性的。结果1.FTO与ESCC患者较差的病理学特点及较差预后相关1.1在m6A修饰调节因子中,FTO的表达具有一定的组织特异性,即在ESCC中的表达高于EAC及癌旁。1.2 ESCC组织的RNA m6A水平降低,而FTO表达明显高于癌旁组织。1.3 FTO高表达患者具有较差的T分期、N分期、TNM分期及较差的生存期。2.FTO促进ESCC的增殖和侵袭转移2.1 FTO过表达细胞有更快的生长速度、可形成更多的集落数,所成的皮下移植瘤更大、移植瘤中Ki67表达水平更高。经抑制剂处理或将FTO敲降后呈现相反变化。2.2 FTO过表达细胞的transwell穿膜细胞数更多、划痕愈合能力更强,且引起间质表型相关的N-cad及Vimentin蛋白表达上调、上皮表型相关的E-cad表达下调;在静脉转移模型中引起更广泛的全身转移、更明显的体重减轻和更短的生存期;抑制剂处理后,这些恶性表型的变化被明显逆转;FTO敲降后,细胞的侵袭转移能力减弱。2.3 FTO挽救实验中,突变型FTO质粒无法像野生型质粒一样,回复FTO敲降导致的ESCC增殖、侵袭能力的减弱以及EMT相关蛋白的表达改变。3.FTO以m6A依赖的方式发挥促癌作用3.1 TCGA-ESCA数据库数据挖掘及细胞内RNA验证后,确定miR-200b簇为FTO的下游miRNAs。3.2 FTO过表达导致miR-200b簇的下调及其pri-miR-200b/a/429的上调,抑制剂处理或直接敲降FTO会产生相反的变化。3.3 miR-200b簇挽救实验中,miR-200b簇可显著逆转FTO过表达引起的食管癌增殖、侵袭恶性表型的变化以及EMT相关蛋白的表达改变。3.4 FTO挽救实验中,FTO野生型质粒而非突变型质粒可导致miR-200b簇的下调、pri-miR-200b/a/429 的上调、pri-miR 200b/a/429 的 m6A 水平及 DGCR8 结合水平的下调。3.5经TCGA-ESCA及miRDB数据库挖掘及miR-200b簇的挽救实验验证,miR-200b簇可显著引起6种分子下调:与增殖相关的分子信号转导和转录激活因子5b（signal transducers and activators of transduction5,STAT5b）、成对同源异型结构域蛋白转录因子 2（paired-like homeodomain transcription factor 2,PITX2）、胶质瘤相关癌基因3（glioma-associated oncogene 3,GLI3）和与侵袭相关的分子锌指E盒增强子结合蛋白 1（zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB1）、锌指 E 盒增强子结合蛋白 2（zinc finger E-box binding homeobox 2,ZEB2）、snail 家族转录抑制因子 2（snail family transcriptional repressor 2,SNAI2）。3.6 FTO过表达的细胞、异种移植瘤中6种下游分子在RNA、蛋白及组织水平的表达明显升高。经抑制剂处理或将FTO敲减则引起其下调。在挽救实验中,FTO突变型质粒对靶基因的表达无明显影响。结论1.FTO在ESCC中的表达高于EAC及癌旁组织,具有一定的组织特异性;FTO与食管癌患者的不良病理学特点及较差预后密切相关。2.FTO以m6A依赖的方式在体内、外促进ESCC的增殖、侵袭、迁移及转移能力。3.FTO通过对pri-miR-200a/b/429去甲基化,减少微处理蛋白复合物成分DGCR8对其的识别、结合,减少pri-miR-200a/b/429进一步的处理,从而减少miR-200b簇的合成;miR-200b簇抑制6种靶基因——与增殖相关的STAT5b、PITX2、GLI3和与侵袭相关的ZEB1、ZEB2、SNAI2——的表达,从而发挥促进ESCC增殖及侵袭转移的作用。