论文部分内容阅读
目的:带核定位信号的维甲酸受体(Nuclear localization signal retinoic acid receptor alpha:NLS-RARα)在急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia:APL)的发生发展中扮演着重要的角色,它是由中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase:NE)切割早幼粒细胞白血病-维甲酸受体(Promyelocytic leukemia-retinoic acid receptor alpha:PML-RARα)融合蛋白形成的。然而,NLS-RARα对APL的作用机制尚未明确,本研究论文探讨NLS-RARα对APL细胞株NB4细胞的作用及其机制。方法:免疫印迹实验和CCK-8增殖实验分别检测全反式维甲酸(All-trans retinoic acid:ATRA)处理后的NB4细胞分化标志物C/EBPβ、CD11b,丝裂原活化蛋白激酶p38α(Mitogen-activated protein kinase p38α:p38αMAPK)表达水平和NB4细胞增殖水平;分子克隆技术构建p38αMAPK真核表达质粒,双荧光素酶实验检测p38αMAPK的转录激活活性;利用慢病毒介导的NLS-RARα基因过表达,进一步用免疫印迹实验验证过表达效率并检测NLS-RARα对NB4细胞分化标志物C/EBPβ、CD11b和p38αMAPK表达水平的影响,同时,CCK-8增殖实验检测NLS-RARα对NB4细胞增殖水平的影响;间接免疫荧光实验分析nls-rarα与p38αmapk的空间共定位,免疫共沉淀实验分析nls-rarα与p38αmapk的相互作用;应用p38αmapk活性抑制剂pd169316研究atra激活p38αmapk后再募集nls-rarα还是atra募集已与p38αmapk结合的nls-rarα后激活p38αmapk。结果:全反式维甲酸(all-transretinoicacid:atra)处理组nb4细胞分化指标c/ebpβ、cd11b,磷酸化的丝裂原活化蛋白激酶p38α(phosphorylated-mitogen-activatedproteinkinase:p-p38αmapk)的量增加(p<0.05),细胞增殖水平下降(p<0.05),p38αmapk表达水平无差异(p>0.05);成功构建p38αmapk真核表达质粒,p38αmapk真核表达质粒转染组的荧光素酶活性增加(p<0.05);成功在nb4细胞中过表达nls-rarα,当未用atra处理细胞时,过表达nls-rarα组nb4分化指标c/ebpβ和cd11b的表达水平下降(p<0.05),p38αmapk和p-p38αmapk的量无改变(p>0.05),当用atra处理细胞时,过表达nls-rarα组nb4分化指标c/ebpβ、cd11b和p-p38αmapk的量减少(p<0.05),p38αmapk表达水平无差异(p>0.05),细胞增殖水平上升(p<0.05);免疫荧光实验和免疫共沉淀实验证实nls-rarα与p38αmapk直接相互作用;p38αmapk抑制剂pd169316的在lv-nls-rarα-nb4细胞中的应用发现,与atra处理组相比,atra+pd169316处理组lv-nls-rarα-nb4细胞中的分化指标c/ebpβ、cd11b和p-p38αmapk的量减少(p<0.05),nls-rarα和p38αmapk表达水平无差异(p>0.05),细胞增殖水平上升(p<0.05),pd169316在293t细胞中的应用发现抑制剂处理组和未处理组中p38αMAPK和NLS-RARα都能发生相互作用。结论:ATRA募集已与p38αMAPK结合的NLS-RARα后,能通过激活p38αMAPK促进APL细胞株NB4细胞分化而抑制其增殖,然而在此过程中,NLS-RARα能够通过下调p-p38αMAPK而抑制ATRA对NB4细胞的效应。