深低温保存是实现细胞与组织长期保存的最有效方法。骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有很强的自我更新和多向分化潜能,BMSCs安全而有效的低温保存是临床应用的关键之一。到目前为止,成功的细胞低温保存大多采用慢速冻存法,而且常用冷冻保护剂中的二甲基亚砜(DMSO)的存在对神经系统有毒性作用且使用牛血清有感染动物病毒的风险并能引起异基因免疫反应,因此,降低冷冻保护剂中DMSO的浓度并替代牛血清对提高细胞临床使用安全性具有重要意义。本文首先以人骨髓来源的间充质干细胞为保存对象,研究了低浓度DMSO(7.5%,5%和2.5%(v／v))与聚乙二醇或海藻糖、白蛋白组合冷冻保护剂对细胞活性及其功能的影响。采用流式细胞仪对冻后细胞的早期凋亡及坏死情况进行了检测分析,以alamarBlue法测定细胞在复苏短期内及后续培养过程中的代谢和增殖情况,并对骨髓间充质干细胞进行成骨、脂肪和软骨诱导分化,考察细胞的多向分化潜能。实验确定了一种成分明确、不含血清且DMSO浓度较低的冷冻保护剂组合(含7.5%(v／v)DMSO,2.5%(w／v)聚乙二醇和2%(w／v)白蛋白),对人骨髓间充质干细胞的冷冻保存效果较好(活率为82.9±4.3%),与传统保护剂10%DMSO的效果相当(活率为82.7±3.7%)。冻存复苏后的细胞很好地保持了体外增殖和分化潜能。结果还表明2%的白蛋白能够有效替代传统保护剂中的牛血清成分。对于不同种属的同种细胞,同一种保护剂可能会显示出不同的保护效果。尽管骨髓间充质干细胞已成功从多种动物体内分离并培养,但是对不同种属来源的骨髓间充质干细胞冷冻保护剂的研究还未见报道。本文对小鼠、大鼠及牛骨髓间充质干细胞进行了冷冻保护剂的比较研究,实验结果表明一种组合冷冻保护剂(含5%(v／v)DMSO,2%(w/v)聚乙二醇,3%(w／v)海藻糖和2%(w／v)白蛋白)对三种骨髓间充质干细胞的保存效果较好；而且在本实验条件下,小鼠骨髓间充质干细胞显示出对低温保存的耐受性最高。在以骨髓间充质干细胞结合生物支架材料构建工程化组织时,细胞在支架材料表面的黏附是非常重要的。本文研究了黏附在不同基质(Gelatin, Matrigel, Matrigel Sandwich)包被的表面上人骨髓间充质干细胞的低温保存,检测了基质材料、冷却速率及冷冻保护剂对黏附细胞的活率、增殖活性、细胞骨架肌动蛋白丝形态等的影响。实验结果表明,基质材料能够较好地维持黏附细胞的冻存后的活性,不同材料上细胞冻后的成活率和增殖能力、细胞内pH及线粒体分布均有所不同,而且活率和增殖能力均显著高于未包被表面组。Gelatin和Matrigel包被能够促进细胞的黏附及生长,但冻存后细胞内的骨架肌动蛋白丝的结构和形态发生了明显的改变。Gelatin包被表面生长的黏附细胞经1℃/min的降温速率冻存后的活性显著高于5℃/min和10℃/min,但是活率显著低于相同冻存条件下的悬浮细胞。本文还对骨组织工程另一种重要种子细胞——成骨细胞的低温保存过程进行了研究。考察了SD大鼠颅骨顶骨来源的悬浮和黏附成骨细胞对渗透压的耐受程度,发现黏附细胞对渗透压的耐受范围远低于悬浮细胞,分别为240-710mmol/kg及228-1605mmol/kg;黏附细胞经不等渗溶液处理后,对细胞进行继续培养也不能恢复细胞活性,慢速冻存后黏附成骨细胞的活率也显著低于悬浮细胞。揭示了渗透压耐受能力差是造成单层黏附细胞冻后活率低的主要原因之一。在细胞和组织的玻璃化法低温保存中,玻璃化溶液的导入和导出方案极大地影响着保存的效果。对于分步法保护剂导入过程,冷冻保护剂与细胞的平衡时间是导入方案中的重要因素。本文以显微镜图像分析法获得了SD大鼠颅骨顶骨来源的成骨细胞膜渗透参数,得到成骨细胞的非渗透体积,结合成骨细胞的Boyle van’t Hoff曲线,计算出成骨细胞的“安全”体积变化范围。利用差示扫描量热系统以及低温冷台系统证实所配制的联合玻璃化冷冻保护剂具有良好的玻璃化能力；利用K-K模型模拟了在玻璃化冷冻保护剂五步导入法中每步导入过程中细胞的体积变化,结合每步导入的细胞毒性实验,设定每步导入之间的平衡时间为90s,90s,90s和60s,导入结束后至冷冻前的平衡时间为60s,导入保护剂后的细胞活率为90.6±2.5%。本文获得的渗透压耐受、细胞体积变化“安全”范围和细胞膜渗透参数有助于以成骨细胞构建的工程化组织玻璃化低温保存方案的设计。