雄激素作为类固醇激素的一种,具有促进蛋白质合成、加速肌肉生长等功能。将雄激素类药物作为饲料添加剂使用,可以达到加快动物育肥的效果。然而,食品动物体内的雄激素类药物可能通过食物链等形式进入人体,造成性早熟、内分泌失调以及诱发癌症等,所以,我国禁止将雄激素类药物用于食品动物的促生长。因此,雄激素类药物的残留检测越来越受到人们的关注。现有的残留分析方法如色谱分析法和免疫分析法无法解决雄激素类药物低剂量、多组分添加问题,且检测成本高,操作复杂。雄激素受体报告基因检测法是一种多残留检测方法,对各种雄激素类药物低剂量多组分添加产生的“鸡尾酒效应”有较好的检测效果,同时成本低廉,操作简便,适用于食品及环境安全监督检查。本研究首先将人雄激素受体(hAR)、五联雄激素响应元件(5ARE)和位于响应元件序列下游的报告基因(Lac Z)构建的质粒pRR-hAR-5ARE/Lac Z转入酵母细胞W303-1A。利用双氢睾酮(DHT)、睾酮、甲睾酮、诺龙、雄烯二酮、群勃龙、美雄酮、宝丹酮和康力龙等9种雄激素类药物刺激重组酵母细胞,验证其反应活性并优化刺激条件。其次,再应用随机点突变技术,筛选相比于野生型雄激素受体(AR-WT)对激素反应活性升高的突变体,并利用冷冻干燥技术探究保存重组酵母细胞的条件和时限。最后,在江苏部分地区养殖场采集饲料、土壤、水样等环境样品,前处理后用重组酵母细胞进行初筛,测定DHT当量(DHTEq),应用HPLC-MS方法对检出的阳性样品进行雄激素类药物鉴别和定量分析,以探究重组酵母细胞在环境雄激素类药物残留检测中应用的准确性。结果如下:1.在9种雄激素类药物作用下,随着激素浓度的升高,重组雄激素受体酵母细胞β半乳糖苷酶表达水平也随着升高,具有良好的剂量-效应关系,EC50范围在32.51-624.76 μg/L。其中天然雄激素DHT、睾酮的去甲衍生物诺龙及其衍生物群勃龙对AR-WT的活性最强,天然雄激素雄烯二酮与其他合成类雄激素对AR的活性相对较弱。2.在不同时间点检测被DHT刺激的重组酵母细胞β半乳糖苷酶表达水平,从6 h开始,β半乳糖苷酶表达水平开始升高;从12 h开始,逐渐趋于平稳达到饱和。3.应用随机点突变技术筛选到对激素反应活性升高的双点突变体G581R/D831E。为了更好地分析突变体在酵母细胞内对激素的反应活性变化,利用定点突变技术构建了 G581R和D831E两个单点突变体。用不同浓度的不同激素刺激AR-WT和突变体重组酵母细胞,检测β半乳糖苷酶表达水平。结果显示,G581R/D831E和G581R的基础活性升高,最大响应值降低,信号窗减小;D831E在信号窗不变的情况下,对激素的反应活性相较于WT均有升高,EC50范围在5.06-69.01 μg/L。因此选用AR-D831E突变体为后续检测基因型。4.通过冷冻干燥技术对重组酵母细胞进行冻干保存,每隔一段时间复苏酵母细胞,检测其反应活性是否衰减。结果显示重组酵母细胞冻干粉至少可以在-20℃保存40d而保持反应活性不变。5.对养殖场采集的63份环境样品用重组酵母细胞初筛,共检出12份阳性样品。HPLC-MS在阳性样品中检测到了 4种雄激素类药物。将HPLC-MS检测结果换算成DHT当量并与重组酵母检测结果作相关性比较,结果显示二者在检测范围内具有良好的相关性,验证了重组酵母细胞检测环境雄激素类药物残留的准确性。本研究成功构建了重组人雄激素受体基因酵母细胞,为建立便捷、准确的环境中雄激素类药物残留检测方法提供了理论依据。