目的前列腺癌是男性生殖系肿瘤中非常重要的一种，在美国前列腺癌发病率在所有恶性肿瘤中居第一位，死亡率占第二位，仅次于肺癌。我国前列腺癌患者的发病率虽远低于西方国家，但近年来呈显著增长趋势。究其原因与生活方式的改变、人们寿命的延长及医疗保健和诊断水平的提高有关。手术治疗预后良好，但大多数前列腺癌患者早期无明显临床症状，一旦确诊己属晚期，失去手术时机，只能以内分泌治疗为主，其疗效常常不佳。癌细胞雄激素非依赖性的转变是前列腺癌发展、转移的重要原因。传统的手术、放疗、化疗和激素疗法对激素难治性前列腺癌（hormone-refractory prostate cancer，HRPC）效果不佳，目前国内外学者都在探求基因水平的调控方法和新靶点。本实验设计、构建针对survivin基因的siRNA表达载体（small interference RNA expression vector），转染入人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞中，观察siRNA表达载体抑制survivin mRNA及survivin蛋白表达、诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡的效果，为进一步筛选有效siRNA提供实验基础，探讨前列腺癌基因治疗的新途径。方法我们首先在Genebank中找到survivin的cDNA序列，参考siRNA的设计原则，根据在线siRNA靶点设计软件siRNA design support system确定2条靶序列及一条阴性序列。用BLAST检索设计的DNA片段序列的特异性，与人类其他编码序列无同源性，阴性序列与survivin mRNA无同源性。构建survivin基因的siRNA表达载体—重组质粒pBSsi-survivin，并经序列分析证实序列完全正确，分别命名为质粒A、质粒B、质粒C（阴性序列）。人PC-3细胞常规培养于含10％胎牛血清1640培养基中，置于37℃，5％CO2细胞培养箱中，每日在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况、细胞生长情况等。待细胞汇合度达到95％-100％，用0.25％的胰酶消化，以1∶2传代扩增，进行传代培养。（1）细胞生长到占培养瓶底约90％时消化，调整细胞浓度为2×105／ml，按每孔1ml等量加到多组6孔培养板中培养。于30-50％细胞汇合度时（处于对数生长期）准备进行转染。（2）实验分为四组，分别为质粒A转染组、质粒B转染组、阴性序列转染组（质粒C组）及空白对照组，分别转染前列腺癌PC-3细胞。转染按invitrogen公司LipofectamineTM 2000脂质体转染法说明书操作。前3组内质粒与Lipofectamine^TM 2000采用1∶6比例。（3）将脂质体及质粒于室温下放置，用前混匀。在含有Opti-MEM^?Ⅰ低血清培养基100ulEp管中加入质粒2ug，轻轻混匀。对照组不加质粒，加入同体积的Opti-MEM（?）Ⅰ低血清培养基。（4）使用前轻轻混合Lipofectamine^TM 2000。在另一个Ep管中用Opti-MEM^?Ⅰ低血清培养基100ul稀释Lipofectaminem^TM 2000 12ul，轻轻混匀后在室温下孵育5分钟。（5）混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine^TM 2000。轻轻混合，在室温下孵育20分钟，以允许复合物的形成。在30分钟内混合稀释的Lipofectamine^TM 2000和稀释的质粒。更长的孵育时间可能会降低活性。（6）培养细胞去上清，用Opti-MEM^TMⅠ低血清培养基洗一次，加800ul Opti-MEM^?Ⅰ低血清培养基，将质粒-Lipofectamine^TM 2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中。通过轻轻地前后摇动培养板混合。（7）转染4h后换用含10％胎牛血清1640培养基，终止转染。于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。24小时后加1.2ug／ml嘌呤霉素筛选，至空白对照组细胞全部死亡后，嘌呤霉素浓度减半继续培养，获得阳性克隆细胞扩增并保存。半定量RT-PCR检测细胞内survivin mRNA表达的变化，图像用Bandscan5．0软件作灰度扫描，用survivin与内参β-actin灰度值比值表示各样本survivin蛋白表达强度。Western blot检测细胞内survivin蛋白表达的变化，图像用Bandscan5．0软件作灰度扫描，用survivin与内参β-actin灰度值比值表示各样本survivin mRNA表达强度。流式细胞仪检测质粒诱导细胞凋亡，观察siRNA表达载体细胞凋亡的影响。实验所得计量资料以均数±标准差表示，采用SPSS11.0进行分析，方差分析法进行各组间差异的比较，p＜0.05认为有统计学意义。结果构建的重组质粒pBSsi-survivin经DNA测序技术证实重组质粒序列与所设计序列完全一致，表明针对survivin基因的siRNA表达载体构建成功。采用Western blot检测转染后各组PC-3细胞中Survivin蛋白的表达，结果4组细胞Survivin蛋白的表达强度分别为18.94％±0.63％、16.35±0.23％、46.41％±0.76％、46.20±1.47％。质粒A、B组与后两组相比差异均有显著性意义（p=0.000），质粒A、B组间比较差异有显著性意义（p=0.007），阴性序列组、空白对照组间比较差异无显著性意义（p=0.771）。采用RT-PCR检测转染后各组PC-3细胞中survivin mRNA的表达，结果各组细胞中survivin mRNA的表达强度分别为27.94％±1.43％、24.51％±1.37％、49.46％±0.71％、48.49％±1.32％。质粒A、B组与后两组相比差异均有显著性意义（p=0.000），质粒A、B组间比较差异有显著性意义（p=0.01），阴性序列组、空白对照组间比较差异无显著性意义（p=0.365）。经Annexin V与PI双染色流式细胞仪检测PC-3细胞的凋亡，质粒A转染组的PC-3细胞凋亡率为12.80％±1.33％，质粒B转染组的PC-3细胞凋亡率为16.48％±1.00％，阴性对照组为3.03％±0.62％，空白对照组为2.96％±0.41％。质粒A、B组与后两组相比差异均有显著性意义（p=0.000），质粒A、B组间比较差异有显著性意义（p=0.001），阴性序列组、空白对照组间比较差异无显著性意义（p=0.934）。结论实验采用RNAi技术，以survivin为靶基因，成功设计、构建两条能够在细胞内表达针对survivin基因的siRNA表达载体，为肿瘤基因治疗的研究提供了物质基础。实验表明RNA干扰可有效抑制前列腺癌PC-3细胞survivin mRNA和蛋白表达，RNA干扰抑制PC-3细胞survivin基因表达诱导PC-3细胞凋亡增加，显示降低survivin基因的表达可以促进PC-3细胞发生凋亡我们设计的2组survivin的siRNA序列，均可有效抑制PC-3细胞survivin mRNA和survivin蛋白表达，促进癌细胞凋亡。质粒B比质粒A抑制效率更高，差异有显著意义。