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膀胱癌是泌尿系统中最为常见的恶性肿瘤，具有较高的发病率及死亡率;与其它恶性肿瘤相类似，凋亡缺陷是膀胱癌细胞的显著特征，表现出增殖与凋亡的失衡以及对化疗药物的抵抗;因此，如何攻克细胞水平上肿瘤细胞的凋亡缺陷与异常增殖并以此来改进现有的治疗方案已成为当前研究的热点。
凋亡抑制蛋白家族IAPs(Inhibitor of Apoptosis Proteins)是近年来发现的极为重要的凋亡抑制因子，能够通过核转录因子NF-κB(Nuclear Factor kappa-enhancer Binding protein)、肿瘤坏死因子TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α)等信号传导通路以及直接或间接抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶Caspases的活性而调控细胞的凋亡;某些IAPs成员在肿瘤细胞中的表达、亚细胞定位还与肿瘤的进展、化疗抵抗以及患者预后密切相关;有报道显示细胞核中Survivin(Survivin-N)的表达是Ta/T1期膀胱癌的生物标记物，并且与Ta/T1期膀胱癌患者的预后密切相关;本课题组之前的系列研究表明，细胞核中cIAP1(cIAP1-N)的过表达与膀胱移行细胞癌的分级、分期、复发率及死亡率密切相关;由此可见，细胞核中cIAP1与Survivin的表达在膀胱癌发生发展过程中发挥着重要的调控作用。
在此基础上，本课题进一步研究cIAP1与Survivin细胞核表达在膀胱癌组织及细胞中的相关性;分析二者亚细胞分布改变对膀胱癌细胞凋亡、周期、迁移及侵袭能力的影响;检测cIAP1与Survivin细胞核表达改变对其他IAPs成员、PTEN及药物敏感性的影响;为以IAPs为靶点的膀胱癌靶向治疗的研究提供理论依据与实验基础。
目的:
1、检测cIAP1与Survivin在膀胱癌组织中的表达及分布情况，分析二者细胞核表达的相关性以及对患者预后的影响;
2、检测cIAP1与Survivin在膀胱癌细胞中的表达及分布情况，检测细胞核中二者是否存在相互作用，观察二者亚细胞分布的改变对膀胱癌细胞凋亡、周期、迁移及侵袭能力的影响;
3、检测cIAP1与Survivin亚细胞分布改变对其他IAPs成员及PTEN表达的影响，检测二者亚细胞分布改变对药物多柔比星敏感性的影响。
方法:
1、应用Western blot与免疫组化方法检测膀胱癌组织中IAPs成员的表达及分布情况;应用Spearman秩相关检验和线性回归分析细胞核中cIAP1与Survivin表达的相关性;应用Kaplan-Meier生存曲线分析cIAP1与Survivin核表达对患者无复发存活率的影响;应用Cox相对危险回归模型进行多变量生存分析;P＜0.05认为具有显著性统计学差异。
2、应用激光共聚焦显微镜观察IAPs成员在膀胱癌细胞系中的亚细胞分布特点，以及应用LMB刺激后，IAPs成员细胞核、质分布的改变情况;应用免疫共沉淀反应检测cIAP1与Survivin在膀胱癌细胞核中的相互作用;应用Hoechst33258染色，Rhodamine-Phalloidin染色，流式细胞仪，细胞划痕实验，ECMatrix gel检测cIAP1与Survivin亚细胞分布改变对膀胱癌细胞凋亡，周期，迁移及侵袭能力的影响。
3、应用Western blot检测cIAP1与Survivin亚细胞分布改变对其他IAPs成员及PTEN蛋白表达的影响;应用MTT、Hoechst33258与Rhodamine-Phalloidin染色检测膀胱癌细胞中cIAP1与Survivin亚细胞分布改变对多柔比星药物敏感性的影响。
结果:
1、cIAP1与Survivin核表达在膀胱癌组织中的相关性及对预后影响的研究
Survivin与cIAP1在不同恶性程度膀胱癌组织中均呈现细胞质与细胞核分布，并且二者在高级别膀胱癌组织中的细胞核表达增加;Spearman秩相关检验和线性回归分析结果显示，Survivin与cIAP1在膀胱癌患者组织标本中的细胞核表达呈现正相关;Kaplan-Meier生存曲线分析表明，膀胱癌患者的平均无复发存活率在高cIAP1与Survivin细胞核表达组相对于二者低细胞核表达组显著降低;Cox相对危险回归模型进行多变量生存分析表明，cIAP1与Survivin核表达是独立于肿瘤分期与分级之外的膀胱癌患者平均无复发存活率的重要的预测因子。
2、cIAP1与Survivin核表达改变对膀胱癌细胞功能影响的研究
激光共聚焦扫描显微镜显示应用LMB刺激之后，cIAP1与Survivin大部分被限制到膀胱癌细胞核中，呈现细胞核表达增高的现象，并且Survivin核表达开始增加的时间(8h)早于cIAP1核表达开始增加的时间(16h)，而LMB对其他IAPs成员的亚细胞分布无影响;在膀胱癌细胞核中Survivin与cIAP1存在相互作用;小剂量的LMB能够引起cIAP1与Survivin亚细胞分布的改变，但尚不能够诱导膀胱癌细胞的凋亡;cIAP1与Survivin亚细胞分布的改变可以使膀胱癌细胞周期出现G2/M期阻滞现象，并能够增加膀胱癌细胞的迁移以及侵袭能力。
3、cIAP1与Survivin核表达改变对其他凋亡调控蛋白影响的研究
LMB作用之后，细胞质中XIAP与Livin的蛋白表达呈现增高的趋势，而cIAP2的表达无显著改变;表明LMB能够通过改变cIAP1与Survivin的亚细胞分布调控XIAP与Livin蛋白的表达，进而对细胞功能产生影响;LMB作用之后，细胞核中PTEN的表达并未发生显著改变，而细胞质中PTEN的表达呈现下降的趋势;LMB与多柔比星联合应用能够显著增加膀胱癌细胞T24的凋亡，表明cIAP1与Survivin亚细胞分布的改变可以增强膀胱癌细胞对化疗药物的敏感性。
结论:
1、细胞核中cIAP1与Survivin的表达在膀胱癌组织中存在相关性，二者共同细胞核表达与膀胱癌患者的预后密切相关;
2、膀胱癌细胞核中cIAP1与Survivin存在相互作用，二者亚细胞分布的改变可以使膀胱癌细胞周期出现G2/M期阻滞现象，并能够增加膀胱癌细胞的迁移、侵袭能力;
3、cIAP1与Survivin亚细胞分布的改变能够增加细胞质中XIAP与Livin的蛋白表达，降低细胞质中PTEN的表达;并且二者亚细胞分布的改变可以增强膀胱癌细胞对化疗药物多柔比星的敏感性。