杀鱼爱德华氏菌(Edwardsieiella piscicida)是一种革兰氏阴性病原菌,对全球水产养殖业危害巨大。深入了解该菌的致病机制,对于新型疫苗的研制具有重要意义。Ⅲ型分泌系统(T3SS)和Ⅵ型分泌系统(T6SS)是该菌的关键毒力因子。杀鱼爱德华氏菌中存在多种关键毒力调控因子,包括本课题利用转座子突变文库技术新近鉴定的三种新颖的调控蛋白:FabR、EnrR和EvrA等。其中FabR可受不饱和脂肪酸分子变构,调节脂肪酸合成和T3SS的表达;EnrR是新型的核结合因子,对染色体基因组低G+C区域进行结合,实现对包括T3/T6SS在内菌体毒力的全局性调控;EvrA可能结合甘露糖-6-磷酸,从而反馈调节对宿主来源的甘露糖的转运以及对T3/T6SS毒力因子的表达。本课题分别构建了 FabR、EnrR和EvrA的表达菌株,通过尝试不同的融合蛋白标签、表达质粒、温度以及纯化工艺,获得了纯度较高的FabR、EnrR和EvrA可溶性蛋白。其中在对FabR结构的探索中,通过融合MBP标签成功纯化FabR,并且获得其初步的结晶条件,蛋白分辨率为4.5 A。针对EnrR,通过融合His6标签进行亲和层析纯化,获得其蛋白的结晶条件,经过X-射线衍射后获得分辨率为2.60 A的EnrR蛋白晶体结构数据,尝试了两种方法以确定蛋白质原子坐标相位:1)通过在培养基中加入硒代甲硫氨酸,纯化获得硒代甲硫氨酸蛋白,进行X-射线衍射,获得2.6 A硒代蛋白;2)采用溴代DNA,从而培养获得EnrR与溴代DNA复合物的晶体并进行X-射线衍射,获得1.70 A蛋白与DNA复合物数据,解析出EnrR结构,获得EnrR与DNA复合物结构,从原子水平阐明EnrR与DNA的相互作用,获得EnrR与DNA结合的潜在关键位点R47和R55。针对EvrA,由于该蛋白高聚化并形成包涵体,本课题采用His6-SUMO融合标签,稳定表达了 EvrA中进行小分子结合功能域的截短蛋白,结果表明EvrA始终以高聚化状态存在。本课题通过等温滴定量热法验证了 EvrA与甘露糖-6磷酸(Man-6P)的直接相互作用。本课题通过对上述三种转录因子的表达、纯化和晶体结构探索,为揭示杀鱼爱德华氏菌中关键毒力调控因子对毒力基因表达的分子机制的深入解析打下了较好的基础。