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大气压低温等离子体是近些年兴起的一种新型微生物诱变技术,对微生物的诱变效率高、遗传稳定性好。本研究以青岛农业大学农产品安全保藏室保藏的酵母菌株 S1为出发菌株,研究了大气压低温等离子体诱变选育耐酒精酿酒酵母的最优条件,通过三级筛选得到了一株优良酿酒酵母S45,测定了酵母菌胞内代谢关键酶对乙醇的耐受性,对大气压低温等离子体诱变酵母菌的机理进行了探究。试验内容与结果如下: 1研究了酿酒酵母大气压低温等离子体诱变的最佳条件,试验采用正交试验以酿酒酵母菌对酒精的耐受性为指标。结果表明:大气压低温等离子体诱变选育耐酒精酿酒酵母菌的最佳条件为酵母菌菌龄12 h、酵母菌浓度为106个/mL、处理电压165 V、处理时间14 min、样品与等离子电极间距4 cm、氩气流速1.0 L/h,在此条件下诱变酵母菌的正突变率平均值为20.38%。 2在最佳条件下对酵母菌S1进行诱变,并对突变菌株进行了三级筛选。结果表明:从429株诱变酵母菌中,通过耐酒精试验、遗传稳定性试验等最终筛选得到一株酒精耐受性强、遗传稳定性好的耐酒精酵母 S45:对酒精的耐受性≥18%,对酒精耐受性提高28.57%;发酵液酒精含量达18.24%,产酒精能力比出发菌株 S1提高了27.51%;发酵液乙酸乙酯产量是S1的1.95倍,产量达到14.4mg/L,并产生新的酯类,即乙酸异戊酯;产杂醇类含量较少,甲醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇的产量分别降低为出发菌株S1的93.75%、67.61%、86.73%、60.87%、47.63%;产醛类含量较少,乙醛产量为出发菌株S1的77.53%。 3研究了酒精浓度对酵母菌丙酮酸激酶(PYK)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、异柠檬酸脱氢酶(ICDH)、异柠檬酸裂解酶(ICL)、乙醇脱氢酶(YADH)的活性的影响。结果表明:PYK、ICDH、YADH三种酶的活性随乙醇浓度的增大呈降低趋势,S45的PYK、YADH酶活性的比S1高且下降缓慢,而ICDH酶活性比出发菌株S1低且下降更快。G6PDH、ICL、MDH三种酶的活性随乙醇浓度的增大而增大,突变菌株S45的G6PDH、ICL酶活比出发菌株S1高且增大较快,两株酵母菌MDH的酶活性相差不大,由此推测酶活性的改变是突变菌株耐酒精性较高、产酒精能力较强的直接原因。 4通过等离子体处理去离子水中活性氧化物(ROS)含量测定试验、酵母菌的细胞周期试验、胞外蛋白及胞外核酸的测定试验、胞内丙二醛含量的测定试验等,对等离子体诱变酵母菌的机理进行了初步的探究。结果表明:经过等离子体处理,去离子水中ROS的含量呈上升趋势,酵母菌细胞胞外蛋白、胞外核酸、胞内丙二醛含量也呈上升趋势,且酵母菌细胞随着等离子体处理时间的延长,处于G1期的细胞百分比逐渐上升,处于S期和G2期的细胞百分比逐渐降低,等离子体处理将酵母菌细胞阻滞在G1时期。