研究背景二硫化碳(Carbon disulfide, CS2)是一种工业上广泛应用的有机溶剂同时也是重要的化工原料,主要应用于粘胶纤维的生产,以及玻璃纸制造、橡胶硫化、谷物熏蒸、衣物去渍剂、石油精制、清漆和石蜡溶解等。在生产过程中,CS2常因其易挥发性而扩散在工作环境中,对暴露在其中的工人造成多器官损害。我国是世界上最大的粘胶纤维生产基地,该行业属于劳动密集型行业,从业人数众多,特别是在长丝和短丝的纺丝车间女工占相当大的比例。CS2是一种多系统毒物,对神经、心血管、生殖、肝脏、肾脏等均有毒性作用。关于CS2生殖毒性的研究发现,暴露Cs2可导致男工性功能下降,睾丸萎缩,精子数目减少、活动力下降和畸形精子率增加；女工多见月经周期异常、痛经、经期延长、血量增多,严重者可引起自然流产、死胎死产等现象。本课题组采用前瞻性研究对欲生育的CS2作业女工进行观察,发现CS2作业女工受孕时间延长,使其获得一次临床可识别妊娠的概率明显降低；通过检测欲生育女工尿样中绒毛膜上皮激素含量发现早早孕丢失率明显增加,有近半数受精卵因不能正常着床而丢失。但其胚胎毒性作用机制尚不明确。许多研究表明,母体对胚胎的免疫耐受是维持正常妊娠的关键,其中淋巴细胞及其分泌的细胞因子起重要作用,但关于CS2暴露致母胎免疫耐受损伤的研究报道较少,并且尚缺少用于筛选和评价早期生殖损伤效应的敏感观察指标。解决以上问题可为职业性CS2暴露女工劳动保护措施的修订和实施提供科学依据。研究目的探讨母胎免疫耐受状况与胚胎植入之间的关系,揭示胚胎植入期CS2暴露致胚胎毒性作用机理,为CS2暴露女工职业劳动保护措施的修订和实施提供理论依据。研究内容1.胚胎植入期孕鼠暴露于不同剂量CS2以及胚胎植入期不同时间点暴露于CS2,观察母体毒性和胚胎毒性。2.胚胎植入期孕鼠暴露于不同剂量CS2以及不同时间点暴露于CS2,单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测脾脏淋巴细胞DNA损伤情况。3.胚胎植入期孕鼠于不同胚胎植入时间点暴露CS2,酶联免疫吸附法(ELISA)检测孕鼠子宫组织中Thl细胞因子IL-2、IFN-γ和Th2细胞因子IL-4、IL-10表达水平。研究方法1.实验动物及分组：清洁级8-12w性成熟昆明种(KM)小鼠,雌性体重为28-32g；同种雄性单笼饲养,雄性36-40g。按雌雄1：1合笼,次日检查阴栓,阴栓阳性日为孕1d,记为GD1。受孕后按体重随机分组。2.促排卵处理：腹腔注射1Ou PMSG,48h后腹腔注射1Ou HCG。3.CS2暴露3.1 CS2暴露剂量分为低、中、高三个水平,分别为157.8mg/kg (0.1LD50)、315.7mg/kg CS2 (0.2LD50)和631.4mg/kg CS2 (0.4LD50);3.2分别于孕第三天(GD3)、GD4、GD5、GD6不同胚胎植入时间点暴露,并分别以GD4、GD5、GD6、GD7、GD9作为观察终点终止实验；3.3单次暴露CS2；3.4暴露方式和体积：腹腔注射；总体积为0.1ml/10g体重；对照组用橄榄油。4.实验方法4.1胚胎毒性实验：各组动物以设计的暴露剂量和暴露时间进行染毒处理。各组孕鼠于GD9脱臼处死,计数胚胎植入数目并称取肝脏、脾脏、肾脏、卵巢、窝重、子宫和胚泡净重量。4.2 SCGE技术检测淋巴细胞DNA损伤实验：各组孕鼠暴露于CS224h后脱臼处死,提取脾脏淋巴单细胞,计数细胞活性率,用SCGE方法检测淋巴细胞DNA损伤。4.3 ELISA法检测Th、Th2细胞因子表达水平实验：各组孕鼠于设计的各观察终点脱臼处死,取子宫制备组织蛋白匀浆,用BCA法测定匀浆样品中的总蛋白量；ELISA方法检测子宫组织中Th1细胞因子IL-2和IFN-y以及Th2细胞因子IL-4和IL-10的含量。5.统计分析方法：采用SPSS 16.0建立数据库,测量指标以x±S表示。各组之间指标进行方差齐性检验；若组间方差齐,采用单因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)进行F检验,差异有显著性时采用Dunnett t test进行暴露组与对照组均数差异的显著性检验；若组间方差不齐,采用非参数统计Kruskal-Wallis Test进行组间比较,Mann-Whitney Test进行两两比较。统计学检验水准设定为a=0.05。研究结果1.胚胎植入期暴露于CS2致小鼠胚胎毒性胚胎毒性：①胚胎植入期暴露于不同剂量CS2,高剂量暴露组的胚胎植入数目、宫胚窝重和胚胎窝重与对照比较差异均有统计学意义(P<0.05),平均植入数目较对照组减少了79.03%,宫胚窝重和胚胎窝重分别减少了75.53%和90.67%,但校正胚胎植入数目后胚胎均重与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。②胚胎植入期不同时间点暴露于CS2,GD4和GD5暴露组的胚胎植入数目和胚胎窝重与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),GD4和GD5暴露组的胚胎植入数目较对照组分别减少了93.65%和90.44%,胚胎窝重也明显低于对照组,但校正胚胎植入数目后胚胎均重与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。母体毒性：胚胎植入期不同剂量、不同时间点暴露于CS2,孕鼠体重增重和肝脏、脾脏等指标与对照组比较差异没有统计学意义。2.胚胎植入期暴露于CS2致孕鼠淋巴细胞DNA损伤①胚胎植入期暴露于不同剂量CS2,彗星头部和彗星尾部DNA含量(HDNA%和TDNA%)、彗星尾长(TL)、彗星全长(CL)、彗星尾矩(TM)、Olive尾矩(OTM)各项指标,高剂量和中剂量暴露组与对照组和低剂量暴露组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。②胚胎植入期不同时间点暴露于CS2, GD4、GD5和GD6暴露组的各项指标与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。3.胚胎植入期不同时间点暴露于CS2对孕鼠子宫Th1、Th2细胞因子表达影响①Th1细胞因子IL-2和IFN-γ表达水平：与对照组相比,GD3暴露组的GD5观察终点和GD4暴露组的GD5、GD9观察终点IL-2表达水平明显增加；GD4暴露组的GD7、GD9观察终点IFN-γ表达水平明显增加(P值均小于0.05)；②Th2细胞因子IL-4和IL-10表达水平：与对照组相比,GD3暴露组的GD4观察终点IL-4表达水平明显降低；GD5暴露组的GD6观察终点IL-10表达水平明显降低；各暴露组的GD9观察终点IL-4和IL-10表达水平均明显降低(P值均小于0.05)；③Th1和Th2各细胞因子比值中多项比值在各暴露组的各观察终点与对照组比较均见明显增加。结论1.胚胎植入期暴露于CS2可导致明显的胚胎毒性,表现为高剂量CS2暴露明显减少胚胎植入数目,是CS2毒性的敏感剂量；GD4和GD5暴露于CS2致胚胎植入数目明显减少,是胚胎植入期CS2毒性作用的敏感时间点。2.胚胎植入期暴露于CS2可导致母体脾脏淋巴细胞DNA损伤,并且损伤程度随着暴露剂量的增加而相应增加。提示胚胎植入期暴露于CS2可能通过损伤淋巴细胞而影响母体对胚胎的免疫耐受,从而导致胚胎植入障碍。3.胚胎植入期暴露于CS2可影响母体子宫组织中Th1、Th2细胞因子表达水平,抑制母体对胚胎形成以Th2为主的免疫应答。以上研究结果表明,胚胎植入期暴露于CS2可损伤母体淋巴细胞的正常功能,造成Th1、Th2细胞因子表达异常,通过影响母体对胚胎的免疫耐受,导致胚胎植入障碍。