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研究背景：肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, MP)是介于细胞与病毒之间,无细胞壁的一类原核细胞型生物,是引起儿童气管炎、支气管炎、原发性不典型肺炎的重要病原体,也是引起成年人社区获得性肺炎的常见病原之一。MP感染具有流行性,通常3-7年有一次流行高峰。人类感染MP后,一般具有2-10年的免疫力。MP主要通过对呼吸道粘膜上皮细胞的黏附和定植感染宿主。其黏附过程由MP的特殊顶端结构黏附细胞器完成,其中P1蛋白被认为是肺炎支原体的主要黏附素。早年基于P1基因重复序列不同的研究,将MP分为Ⅰ、Ⅱ两个基因型。随后,Dorigo—Zetsma等分别在临床分离株Ⅰ型株和Ⅱ型株中分离到5种亚型和3种亚型。Dorigo—Zetsma等又对MP临床分离株进行了测序,发现了P1基因Ⅰ型和Ⅱ型的特异序列可能发生重组。此外,关于MP-P1基因出现变异的报道也屡有出现。临床上,近几年MP肺炎的发病率不断升高,并且常常出现难治性肺炎支原体肺炎(Refractory M. pneumoniae pneumonia, RMPP)的相关报道。但是否与MP亚型的改变有关,目前尚缺乏明确的定论。目前,虽然国外已有少数关于MP亚型及P1基因变异的报道,但国内尚无相关报道。因此,我们采用MP感染儿童的鼻咽吸出物(Nasopharyngeal aspirate, NPA)作为标本,对MP基因进行分型研究并对MP肺炎患儿的临床资料进行统计分析,旨在了解MP亚型的流行状况以及MP亚型与临床的相互关系。目的：根据MP P1黏附蛋白基因限制性酶切图谱对MP感染儿童NPA标本进行MP基因分型研究,旨在了解MP的流行状况以及MP亚型与临床的相互关系。方法：本研究以2009年2月—2009年12月浙江大学医学院附属儿童医院呼吸科因MPP住院患儿的NPA(共300例)作为研究对象,对其进行MP分型及测序。1.收集患儿的NPA；提取MP DNA,进行荧光定量PCR。选取经PCR荧光探针法测定浓度1.0*10^4以上(包括1.0*10^4)NPA作为下一步实验标本,4000转/15分钟离心后取上清于1.5ml离心管中放入-80℃冰箱中冻存备用。2.设计引物ADH1/ADH2和ADH3/ADH4,进行聚合酶链反应(PCR),对P1基因进行扩增；取15μlPCR扩增产物于2%琼脂糖凝胶(含1μg/ml的溴化乙啶)中进行电泳并用凝胶成像分析系统拍照记录结果。3.限制性片段长度多态性(RFLP)分析,分别用HaeⅢ(或HhaⅠ、HpaⅡ、Sau3A)限制性内切酶对PCR扩增产物进行酶切反应；取酶切产物在2%的琼脂糖凝胶中进行电泳并用凝胶成像分析系统拍照并记录结果。4.挑选部分P1-Ⅰ型和P1-Ⅱ型标本以及MP-129标准株和MP-FH标准株进行PCR反应,将其产物送公司进行测序。5.采集并比较不同型别MP感染患儿的下列临床资料：性别、年龄、临床表现、并发疾病、实验室检查结果及治疗情况等。结果：1.用P1基因ADH1/ADH2和ADH3/ADH4特异引物扩增MP-129、MP-FH标准株和300例MP临床标本,分别得到2280bp和2580bp大小的基因片段；2.在用HaeⅢ限制性内切酶对PCR产物进行酶切反应后,MP-129和297例临床标本产生了P1-Ⅰ型的特征性条带,MP-FH和3例临床标本产生了P1-Ⅱ型的特征性条带；3.经过PCR-RFLP实验分析,所有P1-Ⅰ型临床标本均为1b亚型,P1-Ⅱ型临床标本均为2a亚型；4.测序结果显示P1-Ⅰ型临床标本基因序列与标准株MP-129P1基因序列完全相同仅1例出现了非同义点突变：在核酸序列第208位点处出现了点突变(G→A),导致第70位点的氨基酸从P变为S；P1-Ⅱ型临床标本与标准株MP-FHP1基因序列完全相同；5.对临床资料分析发现3例P1-Ⅱ型患儿均为重症MPP患儿,经过大环内酯类药物治疗后病情都得到了改善。结论：1.2009.2—2009.12期间浙江地区发生的MP感染以P1-Ⅰ,1b亚型为主；2.P1基因在保持相对稳定的情况下出现了新的突变；3.MP基因分型可能与病情严重程度有关。