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研究背景 霍乱是由霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，是我国传染病防治法中规定的甲类传染病，也是国际检疫的传染病之一。目前根据O抗原的不同，已经有206个血清型，但在1992年以前，只有O1群霍乱弧菌能引起霍乱的流行和爆发。1992年10月，在印度和孟加拉国出现了一个新的血清群—O139群(VC O139)的大流行，并暂时性地取代了占流行优势的O1血清群，并很快造成全球范围的流行，引起了全球学者的广泛关注。 VC O139是近几年出现的新的血清型霍乱弧菌，其生存能力比ElTor型霍乱弧菌(EVC)强，一些学者提出VC O139将会引起第八次霍乱的世界大流行。越来越多的学者致力于研究这种新型的霍乱弧菌的来源，为霍乱的预防和控制及霍乱疫苗的研制提供理论依据。目前关于VC O139的来源主要有三种观点：一种观点认为VC O139是由EVC突变而来的。VC O139与EVC相比，除菌体抗原与EVC存在差异外，具有很多的相同或相似之处：(1)相同或相似的毒力因子、毒力基因及其调控系统(2)相同大小的限制性内切酶片段(3)电泳分析相似的电泳型(4)CTX遗传单元的数目及其在染色体中的位置基本相同(5)主要毒力基因高度同源郑州大学博士学位论文三株霍乱弧菌基因组文库的构建与鉴定及含ctx中阳性克隆子的筛选 的保守序列(6)相同的定居因子TCP及其调控系统。这些都提示VC 0 1 39可能 是EVC的O抗原突变型，是EVC获得了部分菌体抗原基因同时又丢失一些基因 而变异的结果。另一种观点认为VC 0139是由非01群菌株获得了EVC的毒力基 因而来的，因为VC 0139具有非01群霍乱弧菌的某些特征:如VC 0139具有的 荚膜结构、部分VC 0 139还携带有质粒等。有学者甚至提出VC 0 139本来就存在 于环境中，由于一些有利条件的变化使它们成为优势克隆群而造成霍乱的流行。 由于霍乱弧菌毒力相关基因总是成簇地位于染色体上，而且一般都在几kb至几十kb之间，难以用一般的PCR法扩增并克隆这些基因，这给霍乱弧菌的研究带来了不便。因此到目前为止，VC 0139的来源还不清楚，导致VC 0139的出现的因素也仍然是一个谜，虽然近几年来各国学者对VC 0 139已进行了大量的研究，并取得了一定的成果，但对于其来源问题，但到目前为止，VC 0 1 39的来源还不清楚，还需做大量的工作。 我国1993年在新疆某地首次爆发了由VC 0139引起的霍乱，虽然目前主要由EVC引起霍乱流行，VC 0139主要引起散发，但VC 0139引起的病例有逐年增加的趋势。很多学者对我国新疆1993年分离的VC 0139的分子生物学特征进行了研究，结果表明新疆分离的0 139菌株与印度和盂加拉国分离的0 1 39菌株有较小的差异，不属于同一基因型，但这也不能排除该菌株为输入性菌株的可能。研究目的为了更进一步了解我国新疆分离的vc 0139菌株的分子生物学特征及其来源，本研究拟选用可以插入大片段DNA的粘粒s叩erCOSI为载体，构建新疆0139群菌株xJ93006、国际0139群标准株Mo45的基因组文库;选用pNEBzgs质粒为载体，尝试插入较大的DNA片段，建立新疆EITo:型霍乱弧菌菌株89079的基因组文库，并对三个菌株的基因组文库的质量和实用性作了评价:从三个基因组文库中筛选出霍乱弧菌的主要毒力基因簇ctx中的阳性克隆子，并对其进行分析;同时克隆了新疆EI Tor霍乱弧菌的肠毒素基因(ctxAB)及其启动子序列。本研究为研究我国VC 0 139的来源及构建霍乱的疫苗奠定坚实的华础。实验方法1.粘粒基因组文库的构建:用SDS裂解、酚氯仿抽提的方法提取霍乱弧菌的基因 组DNA。基因组DNA经Satl3AI部分酶切大小为30kb一40 kb或20kb左右的关附刊人学博十学位论文三株霍乱弧菌基因组文库的构建与鉴定及含Ct川，阳性克隆子的筛选 片段。部分酶切的DNA片段用碱性磷酸酶(CIAP)进行去磷酸化。30kb一40 kb的DNA片段与经xbal线性化、CIAP去磷酸化、BamHI酶切的Supereosz 的载体臂相连接，连接产物用入噬菌体包装蛋白混合物体外包装为入噬菌体颗 粒，又噬菌体颗粒转染大肠杆菌XL一Blue MR，利用氨节抗性筛选阳性克隆， 并以混合池的方式保存该基因组文库。 2.质粒文库的构建:将20 kb左右的Sau3AI酶切DNA片段与经BamHI酶切、 CIAP处理的pNEB193相连接，连接产物转化大肠杆菌TBI，利用蓝白筛选实 验筛选阳性菌落，该基因组文库以格式化形式保存。3.地高辛标记探针的制备:大量提取含ctxAB插入片段的重组质粒pNEB一ZcT， 用Ba，:IHI和Hindlll双酶t)]，经琼脂糖凝胶电泳，J一}J Vitagene公司的DAN胶 回收试剂盒回收Zkb的目的片段作为PCR反应的模板。采用PCR掺入法制备 地高辛标一记的CtxAB探针。4.基因组文库中ctx中阳性克隆子筛选与鉴定:采用菌落原位杂交从基因组文库 中初步筛选ctx中阳性克隆子，并运用打点杂交、Sotltllem分子杂交、特异PCR 等方法对ctx①阳性克隆子进一步鉴定。5.ctx中片段的亚克隆:选用适当的限制性内切酶酶切Ctx中阳性克隆子，根据 Southern分子杂交的结果判断目的条带的位置并回收该片段，通过与适当的载 体