毕赤酵母表达系统是一种利用甲醇为唯一碳源和能源,高水平表达外源蛋白的真核表达系统。甲醇有毒,且易燃、易爆,在大规模生产过程中很不安全,而且发酵产物中易有残留,这对毕赤酵母表达系统在工业、食品等方面上的应用产生一定影响。源于三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(p GAP)调控的组成型表达系统在表达目的蛋白时,可在同一碳源(葡萄糖、甘油、油酸或甲醇等)中连续培养,适宜的条件下其组成型表达也可以达到很高的水平,因此利用三磷酸甘油醛脱氢酶启动子替换醇氧化酶启动子的技术成为近年研究的热点。纤维素酶作为一种可以分解纤维素的催化剂,在食品工业、环境保护等方面应用十分广泛。近几年利用基因克隆及表达调控等技术获得活性更高、适用范围更广的纤维素酶的基础研究越来越深入,并且均取得显著进展。随着酶制剂工业的发展,一些大规模生产的微生物酶制剂多倾向采用液态酶制剂,但是液态酶不稳定,易失活,工业上经常采用添加稳定剂和防腐剂的方法来保持液态酶的储存稳定性。因此针对纤维素酶热稳定性差的问题,筛选并优化出液态纤维素酶酶制剂的复合稳定剂具有非常重要的应用价值。本研究利用基因克隆技术,从毕赤酵母基因组DNA中扩增GAP启动子,替换酵母表达载体p PIC9K上的AOX启动子,构建组成型表达载体p PIC9K-gap,先利用报告基因GUS验证其可行性,再将内切纤维素酶eg替换报告基因GUS,构建组成型表达eg的重组载体p PIC9K-gap-eg,通过筛选最终得到在甘油诱导条件下即可分泌内切纤维素酶的组成型毕赤酵母菌株PPGAP-eg4,其酶活为19 U/m L,相对于酶活为16 U/m L的诱导型毕赤酵母GS115(p PIC9K-eg),两者酶活相差不大。对组成型毕赤酵母菌株PPGAP-eg4的产酶发酵条件进行优化,发现当接菌量为0.5%,且在甘油为唯一碳源、添加量是0.5%的条件下连续诱导到第7天,菌株酶活最大,达到40 U/m L,是初始发酵条件下酶活力的2.2倍。为了提高内切纤维素酶的储存稳定性,本试验选择添加各种稳定剂,即在液态酶制剂中添加多元醇类、糖类、金属离子以及蛋白质等物质。结果发现,半乳糖、糊精、明胶对酶的稳定性影响较大,因此,对半乳糖、糊精、明胶三个因素分别取三水平进行正交试验。最终利用单因素试验和正交试验确定了其最佳复合稳定剂的配比为:半乳糖4%、明胶1%、糊精8%。在该复合稳定剂作用下,65℃保温2 h后,酶活保留率达250.67%,显著提高了内切纤维素酶的热稳定性。为进一步确定复合稳定剂对液态酶制剂储存稳定性的影响,探讨了当稳定剂浓度分别为10%、16%、20%时,3个月内酶制剂的残留酶活。得到当稳定剂浓度为10%时,酶制剂的残留酶活在3个月内能保持在50%以上,为内切纤维素酶在工业上更广泛的应用打下了基础。