双酚A和磷酸三苯酯降解菌的分离鉴定及降解机理研究

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环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors,EEDs)的大量使用导致了严重的环境污染问题。具有内分泌干扰效应的双酚A(Bisphenol A,BPA)和磷酸三苯酯(Triphenyl phosphate,TPHP)被广泛应用于工业生产和人类生活中。近年来,BPA和TPHP的内分泌干扰效应对生态环境及人体健康形成了巨大的威胁。如何有效地清除环境中的内分泌干扰物已成为目前研究的热点。利用微生物降解环境污染物进行生物修复效率高、安全且成本低,受到了广泛重视。从电子垃圾污染的河流淤泥中分离获得一株可降解BPA和TPHP的菌株YC-JY1。通过菌落、菌体形态观察、Biolog分析、16S rDNA以及看家基因进化分析,将菌株YC-JY1鉴定为矢野口鞘氨醇菌(Sphingobium yanoikuyae)。利用单因素分析不同条件对菌株降解BPA能力的影响,菌株YC-JY1在温度15-35℃、pH5.5-8.0、NaCl浓度≤0.4%的条件下有较好耐受,而葡萄糖及培养转速对降解速率无显著影响。利用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法对降解BPA中间代谢产物进行检测,并推测出可能的代谢途径。通过模拟土壤修复,菌株YC-JY1明显促进了BPA和TPHP的生物降解,表明菌株具有良好的应用潜能。对菌株YC-JY1的全基因组序列进行测定,并提交到GenBank数据库(登录号CP047218)。菌株YC-JY1含有一个环状基因组(5.48 Mb,GC含量64.08%)和5个质粒(plasmid A,135.3Kb,GC含量61.06%;plasmid B,65 Kb,GC含量59.24%;plasmid C,66.7 Kb,GC含量59.75%;plasmid D,45.5 Kb,GC含量61.31%;plasmid E,15.6 Kb,GC含量60.32%)。预测得到5633个编码序列(Coding sequences,CDS)、12个rRNA基因和66个tRNA基因。通过分析获得了14个可能参与菌株YC-JY1的BPA降解过程的基因,结合代谢中间产物的检测分析,预测了菌株YC-JY1降解BPA的代谢途径。通过基因序列分析,预测了细胞色素P450(CYP450)基因bisdB及铁氧还原蛋白基因bisdA可能参与了菌株YC-JY1降解BPA的过程。添加CYP450抑制剂1-氨基苯并三唑可显著降低菌株YC-JY1对BPA的降解能力,表明CYP450很有可能参与了BPA降解。对基因bisdAB进行克隆表达,Escherichia coli BL21(pET28a-bisdAB)细胞能够降解BPA,证明了BisdAB的BPA降解功能。进一步构建了bisdB基因敲除菌株YC-JY1ΔbisdB且经验证其无降解BPA能力,说明BisdAB是菌株YC-JY1中起始催化BPA降解的重要蛋白。为探索BPA和TPHP降解相关基因,利用pUTmini-Tn5质粒构建降解菌YC-JY1的降解失活突变文库,筛选到5株不能够以BPA或TPHP为唯一碳源良好生长的突变株。对突变序列进行分析后,预测了磷酸单苯酯酶基因phoP可能参与菌株YC-JY1对TPHP的降解,并通过异源表达的方式对其功能进行验证,结果表明PhoP具有水解磷酸单苯酯的活性。
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