前言肿瘤易感基因101(tumour susceptibility gene101)是一个潜在的肿瘤抑制基因，定位于11P15.1-15.2。TSG101蛋白包括N-端为泛素连接酶E2样结构域、脯氨酸富集区(人TSG101第130-205个氨基酸处)和C-端螺旋卷曲结构域(人TSG101第231-302个氨基酸处)及一个稳定盒SB(steadiness box domain)控制其稳定水平。TSG101基因与细胞生长密切相关，细胞中TSG101含量不足或过量均能引起细胞转化或细胞周期紊乱。TSG101的N末端含有一个泛素连接酶催化区UBC，但缺乏其活性作用位点处的半胱氨酸(被酪氨酸取代)，经研究证实TSG101是泛素连接酶的转录抑制子，但只有保留有螺旋卷曲结构的TSG101蛋白质才能够作为转录抑制因子调控转录活性。TSG101作为转录抑制因子，其主要的靶基因为MDM2基因，在此抑制作用中，TSG101通过其UBC区影响MDM2的泛素连接酶催化区，与MDM2形成独自的反馈控制环，通过影响MDM2的稳定性参与MDM2蛋白的降解，而TSG101降解反过来受MDM2的调节。此作用提示TSG101可能与MDM2蛋白一起参与肿瘤的发生。目的本实验通过研究TSG101在肺鳞癌、肺腺癌组织的表达及其与肺癌的临床分期、分化程度、组织学分型及淋巴结转移等临床病理资料的关系以及与MDM2相关性的研究，进一步分析TSG101和MDM2参与肺癌发生、发展的可能机制。材料与方法1、材料收集79例肺癌组织(鳞癌48例，腺癌31例)，其中53例肺癌取自辽宁省肿瘤医院1980-2001年手术切除存档蜡块。另外26例新鲜肺癌组织及26例新鲜癌旁正常肺组织取自中国医科大学附属第一临床医院胸外科2006年5月-2006年7月手术切除标本。2、主要试剂和来源浓缩型鼠抗人TSG101单克隆抗体(sc-7964)购自美国Santa Cruz公司，浓缩型辣根酶标记山羊抗小鼠(ZB-2305)，浓缩型DAB(ZLI-9302)试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。浓缩型鼠抗人MDM2单克隆抗体(sc-965)Santa.cruz公司，用于免疫组织化学染色。3、方法(1)免疫组织化学染色：检测TSG101和MDM2的表达，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(S-P法)。TSG101以癌细胞胞浆或胞核中出现棕黄色颗粒视为阳性染色，MDM2以癌细胞胞核或胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性染色。免疫组化评分标准为：每张切片在400倍镜下观察5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，共计500个细胞；阳性细胞数≦10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分；再按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；最后按照乘积分数分为4个等级：“-”(0，1，2)，“+”(3，4)“++”(6，8)“+++”(9，12)。TSG101免疫组化染色结果判断标准：分数≧3定为阳性，＜3为阴性。MDM2免疫组化染色结果判断标准：≧10％胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。(2)Western Blot：检测TSG101在肺癌组织和正常肺组织中的表达。取新鲜样品(1-2克)加5倍裂解液，剪碎、匀浆超声处理，高速低温离心提取上清蛋白，电泳，转印，经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检查。结果判定为转印膜上出现棕色蛋白条带，并测定蛋白条带的灰度值。4、统计学分析应用SPSS13.0统计软件进行数据处理，采用x~2检验分析各组计数资料，采用Spearman等级相关分析TSG101与MDM2表达的关系，采用t检验分析WesternBlot图像灰度值，P＜0.05为有非常显著性差异。实验结果1、TSG101、MDM2在肺鳞癌、肺腺癌组织和正常肺组织的表达TSG101在正常肺组织中强阳性表达，主要定位于肺泡上皮细胞浆或胞核。TSG101在低分化肺鳞癌、肺腺癌组织中不表达或弱阳性表达，在中-高分化肺鳞癌、肺腺癌组织的阳性表达，主要定位于癌细胞的胞浆或胞核。MDM2在正常肺组织中不表达，在中-高分化的肺鳞癌、肺腺癌阳性表达，在低分化的肺鳞癌、肺腺癌组织强阳性表达。MDM2阳性表达定位于癌细胞的胞浆或胞核。2、TSG101、MDM2蛋白的表达与肺鳞癌、肺腺癌的临床病理学参数的关系TSG101的表达水平与肺癌组织分化(P＜0.05)、淋巴结转移(P＜0.05)等临床病理学参数有显著关系。MDM2表达与肺癌组织的分化(P＜0.05)、分期(P＜0.05)以及淋巴结转移(P＜0.05)等临床病理学参数有显著关系。在47例TSG101阳性表达的肺癌组织中，有32例(68％)MDM2阳性表达，TSG101的表达与MDM2表达呈负相关(P＜0.05)。3、Western Blot结果TSG101在26例肺癌组织和26例正常肺组织中有不同程度的表达，在肺癌组织中的表达明显低于相应的正常肺组织(t=8.578，P＜0.05)讨论肿瘤抑制基因101(tumour susceptibility gene101)最初是由Li等于1996年通过随机纯合子敲除法(Rmldom Homozygous Knock Out,RHKO)在小鼠NIH3T3成纤维细胞中发现，破坏该基因的纯合子功能可能导致细胞发生转化，恢复该基因的功能，细胞则恢复正常生长。在人体多种肿瘤组织中均发现该基因发生了异常剪接而产生了多种剪接变异体，它们在肿瘤发生中作用目前是研究探讨热点。本研究中免疫组化结果显示TSG101在肺鳞癌、肺腺癌组织中有表达，其胞浆表达率可达59.49％，且TSG101在肺癌组织中的表达水平明显低于其在正常肺组织中的表达水平，Western Blot结果也进一步证实了这个结论。TSG101的表达水平与患者的性别、年龄、肺癌组织学分型和TNM分期等临床病理学参数无显著相关，而中-高分化肺癌组织中TSG101表达明显高于低分肺癌组织；有淋巴结转移的组织明显低于无淋巴结转移的组织。Bennett等在对卵巢癌进行的相关研究法中发现TSG101蛋白表达增加。Yun oh等人报道TSG101在肺癌中没有发生突变，野生型的转录片断只发生于正常肺组织中和部分非小细胞肺癌中，在一部分非小细胞肺癌中和小细胞肺癌中存在一定数量的剪接异构体，由于TSG101在肿瘤发生发展过程中出现高水平的异常剪接体，据此认为TSG101mRNA剪接异常与肿瘤的发生发展可能有关，尚有研究结果表明截短剪接体的表达在癌组织中比正常组织及血细胞中多，TSG101基因在肿瘤发生中并没有发生改变，而且其转录子的剪接出现异常，全长转录子减少，使其表达减少。TSG101在肺癌中的低表达可能与肺癌中存在较正常癌旁肺组织更多的剪接变异体所致，所以TSG101蛋白在正常肺组织中高表达，在肺癌中低表达这些结论与我们所研究的结果相一致。Feng等研究报道TSG101蛋白在体外培养的鼠和人体细胞中维持在一个很小的范围，超出该范围即可发生细胞的异常生长，我们的研究TSG101在肺癌中的低表达，提示TSG101基因蛋白在肺癌表达可能是剂量依赖所致。因为TSG101蛋白与一些参与细胞周期的调节蛋白相似，TSG101可能作为一种显性负调节因子参与泛素系统的细胞周期的调节，可通过与泛素靶蛋白或泛素系统中的其他成份成无效复合物来实现这一调节作用。对于TSG101异常剪接体与肿瘤分期关系有研究表明：TSG101异常剪接体水平增高与肿瘤进展有关。我们研究结果显示TSG101蛋白表达与临床TNM分期无明显差异(P=0.0670)，这可能与我们的实验样本量不足有关，有待于扩大样本量进一步证实。MDM2(murine double minute-2,MDM2)为癌基因，对细胞生长有调节作用，其生物学作用是增强细胞的生存活力，使细胞生存期延长，促进细胞增生及肿瘤的生长，在人和鼠的许多组织中都存在，在功能上与P53基因密切相关。MDM2基因在人的胃癌，膀胱癌，肉瘤组织中都有较高的表达，而在其相应的正常组织中的蛋白表达率较低，提示在肿瘤发生过程中，MDM2可能起着一定的作用。本研究实验结果显示MDM2在肺鳞癌、肺腺癌组织中有表达，其胞核表达率为77.21％，MDM2蛋白表达与肺癌组织的分化、分期以及淋巴结转移等临床病理学参数有显著关系，且MDM2在肺癌组织的表达水平明显高于其在正常肺组织中的表达，低分化肺癌组织中MDM2表达明显高于中一高分化肺癌组织，有淋巴结转移的组织明显高于无淋巴结转移的组织。这一结果与文献报道相一致。有研究发现TSG101是泛素连接酶的转录抑制子，但只有保留有螺旋卷曲结构的TSG101蛋白才能够作为转录抑制因子的调控转录活性。TSG101作为转录抑制因子，其主要的靶基因为MDM2基因，在抑制作用中，TSG101通过其UBC区域影响MDM2泛素连接酶催化区，与MDM2形成独自的反馈控制环，通过影响MDM2的稳定性，而调控MDM-P53反馈环，TSG101降解反过来受MDM2的调节，故认为TSG101即是MDM2-P53环的调控因子，也是作用因子，此作用提示TSG101可能在转录水平上与MDM蛋白和P53蛋白一起参与肺癌的发生。本研究发现在低分化肺癌组织中TSG101表达低于中一高分化肺癌组织及正常肺组织，而MDM2表达则高于中-高分化肺癌组织和正常肺组织。即TSG101在肺癌组织的表达与MDM表达负相关(P＜0.05)。因些我们推测TSG101通过负性调控MDM2的表达，可能是肺癌发生的机制之一。总之，肺癌的发生、发展是一复杂的病理过程，其中抑癌基因与癌基因起着重要的作用。我们的研究显示TSG101在肺癌组织中低表达，且其表达水平与MDM2表达负相关。TSG101基因与MDM2基因的相互作用在肺癌的发生发展中的作用的阐明将为肺癌的发生机制及早期诊断提供重要的线索，为肿瘤的防治提供新的希望。结论1、TSG101在正常肺组织中强阳性表达，在肺鳞癌、肺腺癌组织中，随分化水平的降低表达水平下调。2、MDM2在正常肺组织中不表达，在肺鳞癌、肺腺癌组织中随分化水平下降，表达水平增强。3、TSG101和MDM2在肺鳞癌、肺腺癌组织中表达负相关。