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完整的肠粘膜上皮屏障能够有效阻止肠腔内细菌、抗原等有害物质侵入体内,是人体内重要的保护屏障。相关研究表明,在严重感染、创伤、休克和大手术等应激刺激下,肠粘膜受损,其自我修复能力必然降低,可导致肠粘膜上皮完整性被破坏。近年来的研究强调分子信号传导对肠粘膜上皮损伤后的修复和屏障功能重建的关键作用。长期进化以来,肠粘膜已形成了一套损伤后的自我修复机制,包括快速修复和慢速修复。肠粘膜受损时,机体迅速启动快速修复机制来保护肠粘膜,以防细菌、内毒素趁虚而入,相对于细胞增殖,细胞迁移要快得多,首先紧邻缺损部位的活性肠上皮细胞失去其柱状极性并快速迁移,覆盖病灶部位,可在几分钟至几小时内完成修复,随后发生肠上皮的慢速修复机制,肠道干细胞不断增殖分化,并通过移行的方式不断向上迁移以填补减少的细胞数目。细胞迁移过程必然涉及一系列转录和转录后基因修饰水平的调控,miRNA在其中发挥了至关重要的作用,然而,miRNA对肠上皮细胞迁移的作用及机制尚不完全明确。研究显示,健脾益气中药甘草可通过促进肠上皮细胞的增殖、分化和移行等加快肠粘膜屏障损伤的修复。甘草有健脾益气功效,研究表明,甘草中的活性成分甘草酸能够降低肠粘膜通透性,减轻炎症反应,促进肠粘膜屏障损伤修复。本课题旨在研究miR-30c-2-3p在小肠上皮移行修复的作用及机制,同时,初步探讨甘草酸对肠上皮细胞迁移的作用及相关信号通路。目的:研究miR-30c-2-3p对肠上皮细胞增殖、迁移能力的影响;验证miR-30c-2-3p与STIM2之间的靶向调控关系,深入研究miR-30c-2-3p对肠上皮细胞迁移的作用机制及相关信号通路,并初步探讨甘草酸对PYK2/MYLK/MLC2信号通路中的作用,从而为进一步阐明miR-30c-2-3p在肠粘膜损伤修复的作用机制。方法:1.通过MTT实验、EdU实验、细胞划痕实验评价miR-30c-2-3p对肠上皮细胞增殖和迁移能力的影响。2.采用靶基因预测软件预测和分析miR-30c-2-3p可能调节的靶基因,并结合Biotinylated-miRNA pull down实验和双荧光素酶报告基因实验检测miR-30c-2-3p与STIM2之间是否存在靶向调控关系;采用Realtime-PCR技术及Western blot技术进一步检测miR-30c-2-3p对STIM2在mRNA水平和蛋白水平的表达情况,从而验证miR-30c-2-3p对STIM2的靶向调控作用。3.通过Western blot技术、Fura-2 AM钙离子检测的方法,检测miR-30c-2-3p对细胞内钙离子浓度和钙离子相关的MYLK/MLC2信号通路蛋白表达的影响。4.利用FITC标记鬼笔环肽标记F-肌动蛋白骨架,并通过激光共聚焦扫描显微镜观察miR-30c-2-3p对肠上皮细胞骨架的变化。5.通过siRNA技术沉默STIM2及质粒过表达STIM2分别验证miR-30c-2-3p通过靶向调控STIM2促进肠上皮细胞的迁移。6.应用细胞划痕实验、Fura-2 AM钙离子检测、Western blot技术,检测甘草酸对细胞内钙离子浓度和钙离子相关的PYK2/MYLK/MLC2信号通路蛋白表达的影响。结果:1.将miR-30c-2-3p mimic和inhibitor转染进入IEC-6中,细胞增殖实验结果表明各转染组相对于对照组IEC-6细胞增殖能力并没有明显变化;细胞划痕实验结果发现转染48h后各组呈现明显差别,在IEC-6细胞中转染miR-30c-2-3p mimic后细胞迁移速度明显快于miR-30c-2-3p mimic NC组,愈合能力增强(P<0.05),而加入miR-30c-2-3p inhibitor能够抑制这种现象,细胞迁移能力明显减弱,与miR-30c-2-3p inhibitor NC相比差异具有统计学意义(P<0.05)。2.生物信息学软件预测结果显示,STIM2可能为miR-30c-2-3p预测的靶基因,Pull down实验结果表明,miR-30c-2-3p mimic组与STIM2 mRNA结合率明显高于对照组(P<0.05),同时双荧光素酶报告基因实验结果发现,与共转染miR-30c-2-3p mimic NC 和 pEZ-STIM2 3’ UTR 野生型重组质粒(WT)相比,转染 miR-30c-2-3pmimic和pEZ-STIM2 3’ UTR野生型重组质粒的荧光素酶活性明显降低(P<0.05),而转染miR-30c-2-3p mimic和pEZ-STIM2 3’ UTR突变型重组质粒(MUT)则无明显变化,这结果说明miR-30c-2-3p可以直接作用于STIM2 3’ UTR靶序列,下调STIM2的表达;RT-PCR、WB验证表明miR-30c-2-3p过表达时抑制STIM2的基因水平和蛋白水平的表达,miR-30c-2-3p抑制表达时,STIM2的基因水平和蛋白表达水平上调。证实miR-30c-2-3p对STIM2存在调控作用。3.miR-30c-2-3p增加细胞内钙离子浓度,同时上调MYLK、p-MLC2和MLC2的蛋白表达,细胞骨架变化使细胞呈延展状态。4.siRNA沉默STIM2实验结果表明,沉默STIM2能够增加IEC-6细胞内钙离子浓度,上调MYLK的表达,同时增高了 p-MLC2和MLC2蛋白含量,并促进细胞迁移。而过表达质粒STIM2转染实验结果显示,过表达STIM2降低细胞内钙离子浓度,减少钙离子内流,下调MYLK的表达,同时降低了 p-MLC2和MLC2的表达,从而逆转miR-30c-2-3p mimic对IEC-6细胞的促迁移作用。5.50 μ g/mL甘草酸作用IEC-6细胞48h后,甘草酸能显著促进IEC-6细胞迁移,激活PYK2,增加细胞内钙离子浓度,并促进MYLK、p-MLC2和MLC2蛋白的表达。结论:本研究表明,miR-30c-2-3p靶向调控STIM2,增加细胞内钙离子浓度,并影响MYLK/MLC2信号通路蛋白的表达,促进细胞迁移。甘草酸能激活PYK2/MYLK/MLC2信号通路介导IEC-6细胞的迁移。