论文部分内容阅读
里氏木霉是纤维素酶生产的主要工业菌株,其胞外蛋白分泌量可达40g/L以上;同时,其也是异源蛋白表达的良好宿主。然而,里氏木霉表达异源蛋白的产量往往低于内源蛋白,该问题的瓶颈可能发生在蛋白翻译后的折叠分泌过程中。内质网是分泌蛋白合成和成熟的重要场所。分泌蛋白进入内质网后,分子伴侣Bip1协助蛋白折叠,二硫键异构酶Pdi1和氧化还原酶Ero1帮助形成二硫键;此外,其糖基化状态也是检测蛋白折叠和分选的重要信号。糖苷酶Gls2切除糖链A分支的葡糖残基,如蛋白正确折叠,则继续分泌;若折叠错误,则甘露糖苷酶Mns1切除B分支最末端的甘露糖残基,激活内质网关联降解途径(ERAD),运出内质网,在细胞质内被降解;或者由UDP-葡糖基转移酶Gpt1在A分支上重新添加葡糖残基,促进蛋白继续循环折叠。对内质网蛋白折叠途径相关基因进行遗传改造,可有助于促进里氏木霉蛋白折叠和分泌,从而构建高效生产纤维素酶菌株。β-葡萄糖苷酶(BGL)能够将纤维二糖水解成两分子葡萄糖,BGL不足是影响纤维素降解酶系高效水解纤维素的一个瓶颈。研究表明,黑曲霉BGLA的底物特异性和比酶活均比里氏木霉Bgl1高,且对木质素的吸附程度较低,从而间接促进纤维素的酶解。漆酶是一种能够氧化酚类和芳香胺类底物的多铜氧化酶。其主要用于木质素降解、污染物脱毒、生物电极等。漆酶主要存在于担子菌中,因宿主菌难培养、需有毒物质诱导、难分离纯化等局限,阻碍其商业化应用。其异源表达是获得大量优质漆酶的重要途径。本论文构建了bip1、pdi1、ero1、gpt1和gls2基因过表达菌株以及mns1基因敲除菌株,对里氏木霉内质网蛋白折叠途径进行初步改造;此外,利用里氏木霉作为宿主对黑曲霉BGLA和毛栓菌漆酶Lcc1进行了表达研究。具体研究内容如下:(一)里氏木霉内质网蛋白折叠途径改造初步完成。构建了内质网蛋白折叠分子伴侣过表达菌株OEbip1、二硫键异构酶过表达菌株OEpdi1、氧化还原酶过表达菌株OEero1以及蛋白折叠循环关键蛋白葡萄糖基转移酶过表达菌株OEgpt1、糖苷酶过表达菌株OEgls2和甘露糖苷酶敲除菌株△mns1。荧光定量PCR表明,过表达bip1、pdi1及ero1 一定程度上引起内质网非折叠蛋白响应(UPR),但没有激活ERAD途径;过表达gpt1和gls2以及敲除mns1一定程度上引起UPR响应,激活ERAD途径。在DTT处理时,突变菌株的BGL活力要明显高于出发菌株。在内质网蛋白折叠压力条件下,突变菌株的胞外BGL分泌能力要强于出发菌株。此外,相较于出发菌株,内质网蛋白折叠途径改造菌株OEgpt1、OEero1、OEbip1及△mns1的滤纸酶活和BGL酶活得到明显提升。发酵培养第7天,过表达pdi1和bip1菌株的滤纸酶活分别提高43.0%和49.6%;BGL酶活分别提高112.3%和41.7%。OEgpt1、OEero1、OEbip1的内切葡聚糖酶酶活略高于出发菌株QP4,△mns1、OEgls2及OEpdi1的内切葡聚糖酶(EG)酶活略低于出发菌株QP4。所有突变菌株的外切葡糖酶(CBH)活力,没有发生较为显著的变化。(二)里氏木霉成功表达黑曲霉BGLA。利用里氏木霉自身诱导型强启动子pcbh1对黑曲霉BGLA进行表达,成功构建工程菌株SCB18。发酵培养第7天,SCB18菌株的BGL酶活为103.9 IU/mL,较对照菌株提高51.3倍;其滤纸酶活为4.6 IU/mL,较对照菌株提升29.8%。黑曲霉BGLA的过表达在一定程度上引起了 UPR响应,但没有明显激活ERAD途径。黑曲霉BGLA在里氏木霉中表达需要更多的分子伴侣Bip1和二硫键异构酶Pdi1协助完成。另外,木糖渣底物糖化结果表明,SCB18菌株所分泌纤维素酶的纤维素转化率明显高于出发菌株SDC11。其中,以脱木素木糖渣为底物,酶解反应96h时SCB18菌株的纤维素转化率为96.6%;以未脱木素木糖渣为底物,酶解反应96h时SCB18菌株的纤维素转化率为53.1%。SCB18菌株所分泌酶液的转糖基能力较强,以60%葡萄糖作为底物,65℃反应2天,葡萄糖转化率实现最大(17.6%);转糖基产物主要为槐糖、龙胆二糖以及纤维二糖。此外,转糖基产物具有较强的诱导生产纤维素酶的能力,其诱导能力强于乳糖但弱于纤维素,转糖基产物是具有较强经济价值的可替代的可溶性诱导型碳源。(三)里氏木霉表达高氧化还原电势毛栓菌漆酶Lcc1的研究。利用里氏木霉组成型强启动子pcdna1过表达毛栓菌漆酶lcc1基因,共获得7株转化子。毛栓菌漆酶lcc1基因在里氏木霉中成功转录,但发酵培养和ABTS平板显色结果表明过表达菌株漆酶活力均没有被检测到。里氏木霉表达漆酶Lcc1引起了较强的UPR响应,激活了 ERAD途径。漆酶Lcc1可能在里氏木霉中没有完成正确折叠,进而从内质网中运出,在细胞质中被降解。(四)毕赤酵母GS115成功表达毛栓菌漆酶Lcc1及其糖基化突变体蛋白。对漆酶Lcc1的54位和433位两个糖基化位点进行未突变、单突变和双突变,获得未突变Lcc1菌株、单突变N54Q菌株、单突变N433Q菌株以及双突变NDQ菌株。ABTS平板显色结果表明,漆酶活力大小为未突变Lcc1菌株>单突变N54Q菌株>单突变N433Q菌株>双突变NDQ菌株。漆酶纯化和活性检测表明433位天冬酰胺糖基化对漆酶Lcc1保持活性至关重要。未突变Lcc1利用ABTS和2,6-DMP的最适pH均为5.0;且利用ABTS和2,6-DMP最适温度分别为60℃和55℃。